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SMSC-EXO来源lnc...炎性痛的调节作用和机制研究_李明.pdf

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资源描述

1、东南大学学报(医学版)J Southeast Univ(Med Sci Edi)2023,Feb;42(1):22-31收稿日期2022-09-08 修回日期2022-11-11基金项目海南省卫生健康行业科研项目(20A200507)作者简介李明(1983 ),男,湖南衡阳人,副主任医师。E-mail:154367423 qq com通信作者付昆E-mail:18702374435163 com 引文格式李明,贾丙申,李君,等 SMSC-EXO 来源 lncNA-SNHG14 对 OA 大鼠软骨细胞损伤及炎性痛的调节作用和机制研究J 东南大学学报(医学版),2023,42(1):22-31 论

2、著 SMSC-EXO 来源 lncNA-SNHG14 对 OA大鼠软骨细胞损伤及炎性痛的调节作用和机制研究李明,贾丙申,李君,焦拓,付昆(海南医学院第一附属医院 关节外科,海南 海口570100)摘要目的:探讨滑膜间充质干细胞(SMSC)外泌体(EXO)来源的长链非编码 NA(lncNA)SNHG14(SMSC-EXO-SNHG14)对骨关节炎(OA)中软骨细胞损伤及炎性疼痛缓解的作用和机制。方法:通过分离过表达 SNHG14 的 SMSC 的 EXO,获得 SMSC-EXO-SNHG14。使用 SMSC-EXO-SNHG14 治疗 OA 软骨细胞和OA 大鼠。用 IL-1 处理大鼠软骨细胞以

3、建立 OA 的体外模型,通过 CCK-8 和 transwell 测定评估软骨细胞增殖、迁移能力。注射碘乙酸钠建立大鼠 OA 模型。造模 6 周后采集大鼠膝关节标本和背根神经节(DG)进行组织学分析。在模型建立前和模型建立后 1、2、4 和 6 周评估机械缩爪阈值(PWT)和热缩爪潜伏期(PWL),并通过 Western blotting 和 ELISA 检测软骨降解和炎症相关标志物的表达。结果:体外 SMSC-EXO-SNHG14 可被软骨细胞内吞。SMSC-EXO-SNHG14 处理显著减弱了 IL-1 对软骨细胞增殖和迁移的抑制作用(P 0 05),IL-1 诱导的 COL2A1 下调和

4、 MMP13 的上调(P 0 05)。SMSC-EXO-SNHG14 治疗显著上调OA 大鼠软骨组织中的 COL2A1 蛋白和下调 MMP13 蛋白(P 0 05)。在第 2、4 和 6 周,与未处理的 OA 大鼠相比,SMSC-EXO-SNHG14 处理的 OA 大鼠的 PWL 显著改善(P 0 05)。此外,SMSC-EXO-SNHG14 治疗显著减轻了 OA 大鼠 DG 组织中降钙素基因相关肽(CGP)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的上调(P 0.05)。结论:SMSC-EXO-SNHG14 可有效促进 OA 大鼠的软骨修复,以及减轻膝关节炎症和疼痛。关键词长链非编码 NA SNHG1

5、4;滑膜间充质干细胞;外泌体;骨性关节炎;炎症;疼痛;大鼠 中图分类号684 3 文献标志码A 文章编号1671-6264(2023)01-0022-10doi:10 3969/j issn 1671-6264 2023 01 004egulatory effect and mechanism of synovial MSC-EXO-derivedlncNA-SNHG14 on chondrocyte injury and inflammatorypain in OA ratsLI Ming,JIA Bingshen,LI Jun,JIAO Tuo,FU Kun(Department of J

6、oint Surgery,the First Affiliated Hospital of Hainan Medical College,Haikou 570100,China)22 AbstractObjective:To investigate the effect and mechanism of long non-coding NA(lncNA)SNHG14(SMSC-EXO-SNHG14)derived from exosomes(EXO)of synovial mesenchymal stem cells(SMSC)on chondrocyteinjury and inflamma

7、tory pain relief in osteoarthritis(OA)Methods:SMSC-EXO-SNHG14 was obtained by isola-ting EXO of SNHG14-overexpressing SMSC cells OA chondrocytes and OA rats were treated with SMSC-EXO-SNHG14 at chondrocytes were treated with IL-1 to establish an in vitro model of OA,Chondrocyte proliferationand migr

8、ation were evaluated by CCK-8 and transwell assays at OA model was established by injecting sodium io-doacetate The rat knee joint specimens and dorsal root ganglion(DG)were collected for histological analysis 6weeks after modeling For pain assessment,paw withdrawal threshold(PWT)and paw withdrawal

9、latency(PWL)were assessed before model establishment and 1,2,4,and 6 weeks after model establishment The expression ofmarkers related to cartilage degradation and inflammation was detected by Western blotting and ELISA esults:SMSC-EXO-SNHG14 was endocytosed by chondrocytes in vitro SMSC-EXO-SNHG14 t

10、reatment significantly atten-uated the inhibitory effect of IL-1 on chondrocyte proliferation and migration(P 0 05)SMSC-EXO-SNHG14treatment significantly attenuated IL-1-induced down-regulation of COL2A1 and up-regulation of MMP13(P 0.05)In animal studies,SMSC-EXO-SNHG14 treatment significantly up-r

11、egulated the expression of COL2A1 anddown-regulated the expression of MMP13 in cartilage tissue of OA rats(P 0 05)In 2,4 and 6 weeks,the PWLvalues of SMSC-EXO-SNHG14-treated OA rats were significantly improved compared with untreated OA animals(P 0 05)In addition,SMSC-EXO-SNHG14 treatment significan

12、tly attenuated the up-regulation of CGP andiNOS in DG tissues of OA rats(P 0 05)Conclusion:SMSC-EXO-SNHG14 effectively promotes cartilage re-pair in OA rats,and reduces knee joint inflammation and pain Key wordslong non-coding NA SNHG14;synovial mesenchymal stem cells;exosomes;osteoarthritis;inflam-

13、mation;pain;rats骨性关节炎(osteoarthritis,OA)是最常见的退行性关节疾病,其特征是关节软骨进行性退化、软骨下骨增厚、骨赘形成、滑膜炎症和韧带钙化1。OA 的病因是多因素的,包括关节损伤、衰老、肥胖和遗传2-3。然而,目前人们对 OA 发病机制的分子机制仍然知之甚少,而已知的是软骨细胞和炎症在 OA 发展中起着重要作用4。间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)具有多向分化潜能,并已应用于 OA 的细胞治疗。动物研究5 揭示,滑膜 MSC(synovial mesenchymal stem cell,SMSC)的关节内注射对 OA 动物模

14、型具有治疗效果。SMSC 的再生作用归因于其具有抗炎和软骨保护作用的旁分泌机制6。然而,MSC 的许多再生特性应该归因于分泌的外泌体(EXO)7。SMSC 分泌的 EXO 与OA 密切相关,可促进软骨细胞再生、抑制细胞凋亡、改善细胞外基质(extracellular matrix,ECM)平衡,从而影响细胞或组织的命运8。此外,EXO 含有许多功能性非编码 NA(non-coding NA,ncNA),长链非编码 NA(long non-coding NA,lncNA)在 OA 的病理过程中至关重要9。lncNA 小核仁 NA 宿主基因14(small nucleolar NA host ge

15、ne 14,SNHG14)在 OA的治疗中扮演重要角色10,但是 SNHG14 是否通过SMSC-EXO 的转运从而在 OA 中发挥作用仍不清楚。因此,本研究旨在探讨 SMSC 分泌的 EXO 转运的 ln-cNA SNHG14(SMSC-EXO-SNHG14)的功能,为更好地理解 OA 发病机制提供一个新的视角,为 OA 的临床诊治提供新的策略。1材料与方法1 1试剂与耗材大鼠 SMSC 及软骨细胞均购于赛百慷(上海)生物技术股份有限公司。胎牛血清(FBS)购于美国 Gibco公司。重组 SNHG14 过表达质粒 pcDNA3 1(+)-SNHG14(pcDNA-SNHG14)和阴性对照空质

16、粒 pcD-NA3 1(+)-Null(pcDNA-Null)构建于南京金斯瑞生物科技有限公司。Hoechst33342、细胞骨架染色剂 Ac-tin-TrackerGreen、Total NA Kit I 试剂盒、外泌体红色荧光染色剂 PKH26、蛋白酶抑制剂、IPA 裂解缓冲液均购于上海碧云天生物技术有限公司。PrimeScriptT试剂盒购于日本 TaKaa 公司。脂筏标记蛋白 1(Flo-tillin-1)、肿瘤易感基因 101 蛋白(tumor susceptibilitygene 101,TSG101)、CD63、2 型胶原蛋白 A1(collagen 232李明,等 SMSC-EXO 来源 lncNA-SNHG14 对 OA 大鼠软骨细胞损伤及炎性痛的调节作用和机制研究A1,COL2A1)、基质金属蛋白酶 13(matrix metallopro-teinase 13,MMP-13)、降钙素基因相关肽(calcitoningene-related peptide,CGP)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、转化

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