1、论论著著文文章章编编号号：（）激激活活 氨氨基基末末端端激激酶酶（）促促进进 人人颗颗粒粒细细胞胞增增殖殖和和自自噬噬马马亚亚博博，谢谢贤贤国国，原原筱筱潭潭，刘刘新新峰峰，徐徐金金瑞瑞，杨杨易易，（宁宁夏夏大大学学：西西部部特特色色生生物物资资源源保保护护与与利利用用教教育育部部重重点点实实验验室室，生生命命科科学学学学院院微微生生物物与与分分子子生生物物学学系系，宁宁夏夏 银银川川 ）收收稿稿日日期期：；接接受受日日期期：基基金金项项目目：国国家家重重点点研研发发计计划划（）；国国家家自自然然科科学学基基金金（）作作者者简简介介：马马亚亚博博（），女女，宁宁夏夏固固原原人人，硕硕士士研研究
2、究生生 ：；：同同为为第第一一作作者者通通讯讯作作者者，杨杨易易，：摘摘 要要 目目的的 探探究究无无翅翅基基因因 （）对对 人人颗颗粒粒细细胞胞自自噬噬的的作作用用。方方法法 采采用用 重重组组蛋蛋白白（）、抑抑制制剂剂 和和 处处理理 人人颗颗粒粒细细胞胞并并设设置置对对照照组组，法法检检测测 蛋蛋白白表表达达水水平平，免免疫疫荧荧光光细细胞胞化化学学染染色色法法观观察察 组组和和抑抑制制剂剂 组组中中 蛋蛋白白和和颗颗粒粒细细胞胞特特异异性性标标志志物物叉叉头头盒盒 （）的的表表达达共共定定位位。法法检检测测 细细胞胞的的增增殖殖能能力力，法法检检测测 及及其其抑抑制制剂剂 对对 细细胞
3、胞自自噬噬的的影影响响以以及及 氨氨基基末末端端激激酶酶（）和和活活化化 细细胞胞核核因因子子 （）蛋蛋白白的的表表达达变变化化。结结果果 与与对对照照组组相相比比，组组 蛋蛋白白水水平平增增加加，促促进进细细胞胞增增殖殖，微微管管相相关关蛋蛋白白 轻轻链链 （）、蛋蛋白白表表达达增增加加，核核孔孔蛋蛋白白 （）蛋蛋白白表表达达降降低低；组组 蛋蛋白白水水平平降降低低，抑抑制制人人颗颗粒粒细细胞胞增增殖殖，、和和 蛋蛋白白表表达达降降低低，表表达达增增加加。结结论论 激激活活 促促进进 人人颗颗粒粒细细胞胞的的增增殖殖和和自自噬噬。关关键键词词 无无翅翅基基因因 （）；人人颗颗粒粒细细胞胞；细
4、细胞胞自自噬噬；细细胞胞增增殖殖 中中图图分分类类号号 ，文文献献标标志志码码 ，：（），（），（），（）（），（），（），；家家族族（也也称称为为无无翅翅相相关关 整整合合家家族族）是是一一大大类类分分泌泌性性脂脂质质修修饰饰的的信信号号糖糖蛋蛋白白，它它们们在在物物种种间间高高度度保保守守，到到目目前前为为止止，已已在在人人类类和和小小鼠鼠中中鉴鉴定定出出 种种不不同同的的 配配体体 。胚胚胎胎发发育育的的许许多多方方面面，包包括括血血管管生生成成，都都受受到到 家家族族成成员员的的调调控控 。家家族族的的突突变变与与人人类类疾疾病病有有关关，如如癌癌症症、阿阿尔尔兹兹海海细胞与分子免疫学
5、杂志（），（）DOI:10.13423/ki.cjcmi.009473默默症症等等。非非经经典典 分分子子 是是非非经经典典 信信号号的的代代 表表 性性 配配 体体，平平 面面 细细 胞胞 极极 性性 途途 径径（，）和和 途途径径是是 下下游游途途径径中中最最具具特特征征的的 。途途径径通通过过激激活活 氨氨基基末末端端激激酶酶（，）来来调调节节细细胞胞极极性性和和形形态态发发生生活活动动 。途途径径通通过过激激活活磷磷脂脂酶酶 、蛋蛋白白激激酶酶 （，）和和钙钙调调蛋蛋白白依依赖赖性性蛋蛋白白激激酶酶 （，），刺刺激激钙钙敏敏感感酶酶进进而而进进一一步步激激活活活活化化 细细胞胞核核因因
6、子子（，）转转录录因因子子蛋蛋白白活活化化，从从而而调调节节细细胞胞黏黏附附和和运运动动 。自自噬噬是是一一种种降降解解过过程程，异异常常的的细细胞胞成成分分，如如蛋蛋白白质质聚聚集集和和损损坏坏的的细细胞胞器器，被被包包裹裹在在自自噬噬体体的的双双膜膜结结构构中中，与与溶溶酶酶体体融融合合形形成成自自噬噬溶溶酶酶体体，物物质质被被降降解解 。超超过过 个个自自噬噬相相关关基基因因（，）参参与与过过程程的的每每一一个个步步骤骤。其其中中微微管管相相关关蛋蛋白白 轻轻链链 （，）是是酵酵母母 的的哺哺乳乳动动物物同同源源物物，被被认认为为是是自自噬噬的的关关键键调调控控因因子子，参参与与自自噬噬
7、膜膜的的生生长长、自自噬噬物物的的识识别别、自自噬噬体体与与溶溶酶酶体体的的融融合合等等几几个个步步骤骤 。核核孔孔蛋蛋白白 （，）也也是是常常见见的的自自噬噬蛋蛋白白，介介导导特特异异性性自自噬噬底底物物的的选选择择性性识识别别和和降降解解，包包括括蛋蛋白白聚聚集集物物、胞胞内内细细菌菌等等特特异异性性蛋蛋白白。底底物物运运送送到到溶溶酶酶体体后后，与与底底物物共共同同降降解解 。有有研研究究发发现现，高高 和和低低 联联蛋蛋白白（）会会导导致致黑黑素素瘤瘤细细胞胞自自噬噬增增加加 。近近年年来来，辅辅助助生生殖殖技技术术的的发发展展，在在一一定定程程度度上上缓缓解解了了不不孕孕不不育育率率
8、，但但女女性性生生殖殖疾疾病病在在临临床床上上仍仍未未取取得得有有效效成成果果，如如何何利利用用 信信号号通通路路调调控控机机制制预预防防和和治治疗疗卵卵巢巢疾疾病病是是未未来来主主要要的的研研究究方方向向之之一一 。研研究究发发现现，典典型型的的 信信号号在在前前颗颗粒粒细细胞胞（，）向向颗颗粒粒细细胞胞（，）的的过过渡渡中中发发挥挥着着重重要要作作用用，这这是是支支持持卵卵母母细细胞胞生生长长的的重重要要步步骤骤 。等等 发发现现卵卵巢巢功功能能相相关关的的特特定定生生长长因因子子可可能能通通过过 在在卵卵巢巢中中发发挥挥作作用用。颗颗粒粒细细胞胞在在生生殖殖中中至至关关重重要要，原原始始
9、卵卵泡泡的的形形成成需需要要卵卵母母细细胞胞和和颗颗粒粒细细胞胞的的参参与与，两两种种细细胞胞的的同同步步化化以以及及两两者者之之间间的的相相互互作作用用决决定定了了卵卵母母细细胞胞的的存存活活和和功功能能 。人人颗颗粒粒细细胞胞肿肿瘤瘤细细胞胞系系，保保持持了了 的的大大部部分分正正常常生生理理特特性性，由由于于其其在在培培养养过过程程中中良良好好的的生生长长能能力力，所所以以 细细胞胞通通常常被被用用于于研研究究 的的分分子子机机制制和和功功能能 。材材料料和和方方法法 材材料料 人人卵卵巢巢颗颗粒粒细细胞胞来来自自 细细胞胞库库。培培养养基基、胰胰蛋蛋白白酶酶、胎胎牛牛血血清清（，）购购
10、自自 公公司司；青青霉霉素素、链链霉霉素素购购自自 公公司司；重重组组 （，）购购自自 公公司司；抑抑制制剂剂 分分子子式式 ，购购自自 公公司司；拮拮抗抗剂剂抑抑制制剂剂 即即 叔叔丁丁氧氧 羟羟 基基 六六 肽肽 ，分分子子式式 ，购购自自 公公司司；兔兔抗抗无无翅翅型型 整整合合位位点点家家族族成成员员 （，）抗抗体体、兔兔抗抗 抗抗体体、兔兔抗抗 抗抗体体、兔兔抗抗叉叉头头盒盒 （，）抗抗体体、兔兔抗抗 抗抗体体、异异硫硫氰氰酸酸荧荧光光素素（，）标标记记的的山山羊羊抗抗小小鼠鼠 （）、四四甲甲基基异异硫硫氰氰酸酸罗罗丹丹明明（，）标标记记的的山山羊羊抗抗兔兔 （）购购自自 公公司司；
11、兔兔抗抗 抗抗体体、兔兔抗抗 抗抗体体购购自自 公公司司；小小鼠鼠抗抗 抗抗体体购购自自 公公司司；辣辣 根根 过过 氧氧 化化 物物 酶酶（，）标标记记的的山山羊羊抗抗兔兔 购购自自北北京京中中杉杉金金桥桥生生物物科科技技有有限限公公司司；购购自自 公公司司；二二辛辛可可宁宁酸酸（，）蛋蛋白白定定量量检检测测试试剂剂盒盒购购自自凯凯基基生生物物公公司司；多多聚聚甲甲醛醛固固定定液液购购自自北北京京索索莱莱宝宝科科技技有有限限公公司司；购购自自 公公司司；驴驴血血清清购购自自北北京京庄庄盟盟国国际际生生物物基基因因科科技技有有限限公公司司；试试剂剂盒盒购购自自 公公司司。方方法法 细细胞胞复复
12、苏苏、培培养养、传传代代 冻冻存存的的 细细胞胞从从 取取出出，置置于于 温温水水中中快快速速摇摇晃晃直直至至完完全全溶溶解解。离离心心后后，用用 清清洗洗，置置于于 含含 、青青霉霉素素、链链霉霉素素的的 培培养养基基中中培培养养。当当细细胞胞生生长长至至 左左右右时时，用用 胰胰蛋蛋白白酶酶消消化化 细细胞胞，离离心心并并用用 清清洗洗，更更换换新新的的培培养养基基，于于 ，培培养养箱箱中中培培养养。法法检检测测 细细胞胞 、和和 蛋蛋白白表表达达水水平平 取取 细细胞胞，按按每每孔孔 个个细细胞胞接接种种 孔孔板板；待待细细胞胞贴贴壁壁，设设置置对对照照组组、组组、组组和和 组组 。培培
13、养养 后后，弃弃去去培培养养基基并并用用 洗洗涤涤 次次，再再用用全全蛋蛋白白提提取取试试剂剂盒盒抽抽提提细细胞胞蛋蛋白白，、离离心心 期 马亚博，等 激活 氨基末端激酶（）促进 人颗粒细胞增殖和自噬 ，收收集集上上清清。用用 蛋蛋白白定定量量检检测测试试剂剂盒盒检检测测蛋蛋白白浓浓度度，向向上上述述蛋蛋白白样样品品中中加加入入 上上样样缓缓冲冲液液，沸沸水水浴浴 ，蛋蛋白白样样品品 保保存存。按按照照每每孔孔 蛋蛋白白样样品品进进行行电电泳泳，转转膜膜，室室温温下下封封闭闭 ，洗洗膜膜后后，分分别别加加入入兔兔抗抗 多多克克隆隆抗抗体体（），兔兔抗抗 单单克克隆隆抗抗体体（），兔兔抗抗 单单
14、克克隆隆抗抗体体（），兔兔抗抗 单单克克隆隆抗抗体体（），兔兔抗抗 单单克克隆隆抗抗体体（），兔兔抗抗 单单克克隆隆抗抗体体（），孵孵育育过过夜夜；洗洗膜膜，加加入入 标标记记的的山山羊羊抗抗兔兔 （），室室温温孵孵育育 ；经经 洗洗膜膜后后，使使用用 显显色色液液（）进进行行显显色色。采采用用 软软件件分分析析蛋蛋白白吸吸光光度度（）值值，计计算算蛋蛋白白相相对对表表达达量量。免免疫疫荧荧光光细细胞胞化化学学染染色色检检测测不不同同处处理理下下 细细胞胞的的 表表达达 取取 细细胞胞，按按每每孔孔 个个细细胞胞接接种种 孔孔板板。待待细细胞胞贴贴壁壁，设设置置对对照照 组组、组组、组组。培培
15、养养 ，弃弃去去培培养养基基并并用用 洗洗涤涤 次次，每每次次 ；用用 多多聚聚甲甲醛醛固固定定液液固固定定细细胞胞 ；洗洗涤涤 次次，每每次次 ，使使用用 通通透透细细胞胞约约 ；经经 洗洗涤涤后后，加加入入 驴驴血血清清室室温温封封闭闭 ；移移去去封封闭闭液液后后加加入入小小鼠鼠抗抗 单单克克隆隆抗抗体体（），兔兔抗抗 单单克克隆隆抗抗体体（），湿湿盒盒 孵孵育育过过夜夜；经经 洗洗涤涤后后，分分别别加加入入 标标记记的的山山羊羊抗抗小小鼠鼠 （）（）或或 标标记记的的山山羊羊抗抗兔兔 （）（），避避 光光 孵孵 育育 ；洗洗 涤涤 后后，加加 入入 （），室室温温避避光光孵孵育育 ，洗洗
16、涤涤后后，荧荧光光显显微微镜镜下下观观察察并并拍拍照照。法法检检测测 对对 细细胞胞增增殖殖的的影影响响 胰胰蛋蛋白白酶酶消消化化 细细胞胞，细细胞胞悬悬液液用用 清清洗洗 次次，将将细细胞胞接接种种于于 孔孔板板，每每孔孔 完完全全培培养养基基，加加入入 个个颗颗粒粒细细胞胞，放放入入培培养养箱箱中中培培养养。待待细细胞胞贴贴壁壁后后（），设设置置 组组、处处理理组组、对对照照组组、空空白白组组；对对照照组组加加入入细细胞胞悬悬液液和和 试试剂剂，空空白白组组只只加加入入完完全全培培养养基基，每每组组设设 个个复复孔孔。培培养养箱箱培培养养 ，取取出出细细胞胞每每孔孔加加入入 溶溶液液，孵孵育育 ，酶酶标标仪仪测测定定 处处的的吸吸光光度度（）值值。统统计计学学分分析析 采采用用 软软件件分分析析蛋蛋白白吸吸光光度度（）值值，所所有有数数据据均均采采用用 统统计计软软件件进进行行统统计计学学分分析析。颗颗粒粒细细胞胞中中 、和和 蛋蛋白白表表达达水水平平均均以以 表表示示，多多组组间间样样本本均均数数比比较较采采用用单单因因素素方方差差分分析析，组组间间均均数数两两两两比比较较采采用
