1、第 卷第期 年月西 安 交 通 大 学 学 报（医 学 版）（）本刊网址：微信公众号：西安交通大学学报医学版基础研究 在 小鼠中通过抑制 信号通路下调 表达李彦军，王宇星，杨嘉凯，章培军，李宛容，张威，刘杨青，张年萍（山西大同大学医学院免疫学研究所，山西大同 ；山东大学基础医学院医学遗传学系，山东济南 ）摘要：目的探究法舒地尔（）在实验性自身免疫性心肌炎（，）小鼠治疗中发挥的作用及机制，为临床上 治疗心肌炎提供理论依据。方法以 雄性小鼠为研究对象，使用 多肽构建 小鼠模型。单个核细胞分离和培养检测小鼠脾脏中单个核细胞的数量变化，染色、染色和免疫组化分别检测小鼠心肌组织的炎症浸润情况、纤维化情况
2、和 的表达，检测 和白细胞介素（）蛋白的表达，检测促炎因子（、和）、和 信号通路的关键基因表达。结果 小鼠心脏明显增大发白、增加、下降和增大，心肌组织炎症浸润和纤维化加重。小鼠经过 治疗后，上述的症状或者病理特征得到改善。进一步分析发现，小鼠心肌组织中促炎因子 、和 明显增加，但是经过 治疗后只有 的表达下调具有统计学差异，此外，还发现 信号可能也在 治疗 发挥重要作用。和 的表达具有一致性，经过 治疗后，信号通路的关键基因（、和 ）显著下调。结论 在 小鼠中通过抑制 信号通路下调 的表达，从而发挥保护作用。关键词：法舒地尔；实验性自身免疫性心肌炎；信号通路；中图分类号：文献标志码：，（，；，
3、）：（），（，），收稿日期：修回日期：基金项目：山西省基础研究计划青年项目（）；山西省高等学校科技创新项目（）；山西省大学生创新创业训练计划项目（）；山西大同大学博士科研启动项目（）；山西大同大学大学生创新创业项目（）（），（），（），（），（）通信作者：张年萍，教授，：。李彦军与王宇星为共同第一作者。网络出版时间：网络出版地址：期李彦军，王宇星，杨嘉凯，等 在 小鼠中通过抑制 信号通路下调 表达本刊网址：微信公众号：西安交通大学学报医学版 ，（，）：；心肌炎可以分为感染性和非感染性心肌炎两大类，患者主要表现为呼吸困难、胸痛、心律失常、心力衰竭、心肌收缩甚至是猝死，是导致青壮年猝死的主要原因。
4、已有临床试验结果证实，通过短期的免疫抑制治疗心肌病，患者的症状可以得到改善。心肌炎患者通常会出现淋巴细胞亚群和巨噬细胞数量的改变以及抗体介导的损伤。实验性自身免疫性心肌炎（，）小鼠模型是目前研究心肌炎发病免疫机制最常用的实验模型。法舒地尔（）抑制剂在心血管疾病治疗中发挥着重要的作用。在哺乳动物中，存在两种 丝 氨 酸苏 氨 酸 蛋 白 激 酶 同 源 物 和 ，在细胞的增殖、转移、凋亡和周期调控等多种生物学过程中发挥着重要作用。此外，有研究表明，在心脏生理学中也发挥重要作用，在心脏肥大、纤维化和系统性高血压等多种心血管病理过程中异常激活。信号是一种高度进化保守的信号通路。受体家族由四种蛋白质（
5、）组成。其配体有 、和 ，以及 和 。决定 淋巴细胞与淋巴细胞命运的关键调节信号。参与胸腺细胞发育的早期 、和 阶段，在 细胞的调节和分化中至关重要。由于心肌炎表现为胸痛、呼吸困难和心悸等症状，通常与冠状动脉疾病等常见疾病相似，因此常被忽视，寻找有效的预防和治疗方法显得尤其重要。本研究主要利用 小鼠模型探究 抑制剂在治疗心肌炎的作用及机制。材料与方法小鼠 只周龄 雄性小鼠，购买于华阜康生物科技有限公司。动物实验被山西大同大学医学与生物学伦理委员会批准。主要材料及试剂培养基、青霉素和链霉素购买于 公司，胎牛血清购买于 公司，购买于 公司，多肽（）购买于吉尔生物有限公司，完全弗氏佐剂购买于 公司，
6、培养皿和单细胞滤网购买于 公司，细胞裂解液和蛋白酶抑制剂购买于碧云天生物科技公司，试剂、化学发光检测试剂盒和逆转录酶购买于 公司，购买于 公司，、引物和 染液购买于生工生物工程（上海）股份有限公司，染色试剂盒购买于索莱宝生物有限公司，显色液购买于中杉金桥生物技术有限公司，（货号 ）和 （货 号 ）购 买 于 公 司，（货 号 ）购买于华安生物科技有限公司。小鼠模型构建及治疗 雄性小鼠随机分为组，佐剂对照组、组、对照组和 治疗组各 只。佐剂对照组：在第天和第天腹股沟皮下多点注射总量为 的佐剂稀释液（佐剂:生理盐水:）；组：在第天和第天两次免疫，在小鼠腹股沟皮下多 点 注 射 总 量 为 含 多肽
7、（）的免疫混悬液；对照组：第天开始，隔天在 小鼠腹腔注射 生理盐水，直到 处死；治疗组：第天开 始，隔 天 在 小 鼠 腹 腔 注 射 （），直到 处死。脾脏单个核细胞的获取取小鼠的 整 个 脾 脏 于 溶 液 中 充 分 研 磨，清洗次，每次 离心 ，然后用单细胞滤网过滤并 离心 ，最后加入 培养基重悬后移入 培养皿中，、培养，统计每组每只小鼠脾脏培养出的单个核细胞数量。西 安 交 通 大 学 学 报（医 学 版）第 卷本刊网址：微信公众号：西安交通大学学报医学版 和 染色分析小鼠心尖组织的炎症浸润和纤维化程度染色步骤参考文献 。小鼠心尖组织切片后染色和拍照，采用双盲法，名病理学专家同时对小
8、鼠炎症情况评分。评分分为个等级，炎症浸润、和 分别记为“”“”“”“”和“”，根据评分对比分析各组小鼠心尖组织炎症浸润程度。染色：石蜡切片脱蜡至水，铁苏木素染液染色 ；蓝化液处理 后，水洗 ；磷 钼 酸处理 ，苯胺蓝染液染 色 ，乙醇脱水脱色 ，二甲苯透明封片，显微镜拍照。利用 统计分析蓝色区域的比例，根据蓝色区域占比分析对比各组小鼠心尖组织纤维化程度。免疫组化检测小鼠心尖组织 的表达免疫组化步骤参考文献 。小鼠心尖组织切片后染色和拍照，利用 统计分析棕色区域的比例，得染色区域的比例。检测 和 蛋白的表达 裂解液提取细胞总蛋白，法蛋白定量后，使用 总蛋白变性后进行 ，具体实验步骤参考文献 。（
9、兔抗）:，（兔抗）:，（兔抗）:；二抗（兔抗或鼠抗）:。检测 和 等基因的表达 提取 ，逆转录及定量 步骤参考文献 。为内参，根据 计算不同样品之间目的基因的表达差异。所用引物序列见表。统计学分析利用 ，数据以 导入处理，然后采用两组数据对比检验计算值。为差异有统计学意义。表 各基因的引物序列 引物名称引物序列（）结果 小鼠模型成功建立 组小鼠的心脏明显增大并且略显发白。称量每组小鼠的初始体质量、最后体质量和心脏重量发现，与佐剂对照组相比，组小鼠心脏重量明显增加，差异有统计学意义（图 和图，表）。计算小鼠体质量的变化和心脏重量与体质量的比值，结果显示，组小鼠与佐剂对照组相比体质量明显减轻（图，
10、表），心脏重量与体质量的比值明显增大（图，表），以上结果说明 小鼠模型建立成功。：佐剂对照组与 组小鼠心脏代表性图；：与佐剂对照组相比 组小鼠体质量减轻，；：与佐剂对照组相比 组小鼠心脏的重量增加，；：与佐剂对照组相比 组小鼠心脏重量与体质量的比值明显增大，。图与佐剂对照组相比 组小鼠、和 的变化 ，期李彦军，王宇星，杨嘉凯，等 在 小鼠中通过抑制 信号通路下调 表达本刊网址：微信公众号：西安交通大学学报医学版表佐剂对照组和 组小鼠、和的变化 ，指标佐剂对照组（?）组（?）（）（）（）（）（）：小鼠的初始体质量；：小鼠最后体质量；：小鼠体质量的变化；：小鼠心脏的重量。处理改善 小鼠的症状与 对
11、照组相比，治疗组小鼠心脏明显减小，称量小鼠的初始体质量、最后体质量和心脏的重量发现，治疗组心脏重量明显减轻，且具有统计学意义（图 和图，表）。计算两组小鼠体质量的变化和心脏重量与体质量的比值，结果显示，治疗组小鼠与 对照组相比体质量明显增加（图，表），心脏重量与体质量的比值明显升高（图，表）。染色结果显示，组小鼠与佐剂对照组相比蓝色占比明显增加，说明小鼠心肌组织纤维化明显增加且具有统计学差异，治疗组小鼠与 对照组相比蓝色占比明显减少，说明小鼠心肌组织纤维化得到缓解且具有统计学差异（图 和图）。以上结果说明，治疗能够明显改善 小鼠的症状。：治疗组小鼠与 对照组小鼠心脏代表性图；：与 对照组相比
12、治疗组小鼠体质量增加，；：与 对照组相比 治疗组小鼠心脏的重量减轻，；：与 对照组相比 治疗组小鼠心脏重量与体质量的比值明显减小，；：组小鼠心肌组织 染色代表性图；：佐剂对照组、组、对照组和 治疗组小鼠心肌组织纤维化比例，。图与 对照组相比 治疗组小鼠、和心肌组织纤维化的变化 ，处理改善 小鼠的炎症结果显示，与佐剂对照组相比，组小鼠心肌组织炎症浸润明显增加，治疗组小鼠与 对照小鼠对比心肌组织炎症浸润得到缓解，炎症评分均具有统计学差异（图 和图）。单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，单个核细胞数量的增加能够间接反映出机体的炎症状况。脾脏是小鼠最大的免疫器官，因此，分离培养小鼠脾脏单个核细胞能够反映
13、小鼠的炎症情况。将小鼠整个脾脏研磨后培养发现，组小鼠与佐剂对照组西 安 交 通 大 学 学 报（医 学 版）第 卷本刊网址：微信公众号：西安交通大学学报医学版相比，单个核细胞的数量明显增加，治疗组小鼠与 相比单个核细胞的数量明显减小，且均具有统计学差异（图）。表 对照组和 治疗组小鼠、和 的变化 ，指标 对照组（?）治疗组（?）（）（）（）（）（）：小鼠的初始体质量；：小鼠最后的体质量；：小鼠体质量的变化；：小鼠心脏的重量。显著降低 小鼠心肌组织中 的表达 检测结果显示，组小鼠与佐剂对照组相比促炎因子 、和 均明显增加，且具有统计学意义，但 治疗后与对照组小鼠相比只有 明显降低且具有统计学差异
14、，而 和 并 无 统 计 学 差 异（图 、图 和图）。同时结果显示，组小鼠与佐剂对照组相比 和 均增加，治疗后，和 均减小，但 具有统计学差异，无统计学差异（图 和图）。以上结果显示，可以改善 小鼠的症状可能是通过降低促炎因子 的表达而实现的，可能还与 的活性抑制相关。：组小鼠心肌组织 染色代表性图；：小鼠心肌组织炎症浸润评分；：小鼠脾脏分离培养单个核细胞的数量，。图 治疗能够降低 小鼠心肌组织的炎症 抑制 信号通路降低 的表达 结果显示，在 小鼠心肌组织中 和 的表达均增加，当使用 治疗后两者表达明显降低（图）。免疫组化进一步证实小鼠心肌组织中 的表达结果和 结果一致（图 和图）。利用 检
15、测了 信号通路的下游靶基因，结果显示 、和 在 小鼠心肌组织中的表达明显上调。经过 治疗后三者的表达均下调，但是 和 具有统计学差异而与 没有统计学差异（图、图、图 和图）。以上结果充分证实，治疗 小鼠降低促炎因子 的表达是通过抑制 信号通路实现的。讨论心肌炎是一种炎症性心脏疾病。非感染性心肌炎由有毒物质和药物（如免疫检查点抑制剂）、全身性免疫疾病等诱发。不同类型心肌炎的病因、诱发和病程差异很大，是心肌炎治疗的重要挑战。本研究发现，小鼠利用 治疗后，与治疗对照组小鼠相比，降低，增加，降低，心肌组织的炎症浸润和纤维化程度减轻，脾脏期李彦军，王宇星，杨嘉凯，等 在 小鼠中通过抑制 信号通路下调 表
16、达本刊网址：微信公众号：西安交通大学学报医学版：检测促炎因子 、和 的表达，；、：检测 和 的表达，。图 检测促炎因子和 信号通路关键基因的表达 ：检测 和 的表达；：组小鼠心肌组织 染色代表性图；：免疫组化检测佐剂对照组、组、对照组和 治疗组小鼠心肌组织 着色比例；：检测 、和 的表达。，。图 通过抑制 信号通路的活性降低 表达 西 安 交 通 大 学 学 报（医 学 版）第 卷本刊网址：微信公众号：西安交通大学学报医学版单个核细胞数量明显减少等，证实 在 小鼠 的 治 疗 中 发 挥 着 重 要 的 作 用。进 一 步 探 究 发挥作用的机制，发现促炎因子 、和 的 表达在 小 鼠心 肌 组织 中 均 升 高，治疗后都有所下降，但 的变化最为明显，因此重点探讨了。结果显示，在小鼠的心肌组织中 和 的表达具有一致性，并且还发现 信号通路的相关靶基因 、和 都有明显的变化。以上所有结果证实，改善 小鼠的症状是通过抑制 信号通路的活性，进一步抑制 的表达而发挥作用。研究还发现，信号异常，尤其是 和 ，文献中已经有报道 信号在自身免疫性疾病中发挥重要作用，因此，未来的研究可以重点向该方向探
