1、2023 年 第 4 卷 第 1 期|Synthetic Biology Journal 2023，4（1）：86-101靶向DNA的类CRISPR/Cas系统的蛋白工程化改造梁丽亚，刘嵘明（大连理工大学生物工程学院，辽宁 大连 116024）摘要：Clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）/CRISPR-associated（Cas）protein是细菌或古细菌特有的一种获得性免疫系统，自从研究人员将其改造为基因编辑工具之后，CRISPR/Cas系统高效的基因编辑能力对生命科学、生物工程、生物医药、食品及
2、农业科学等多个领域引发了革命性的影响。然而，研究者们发现CRISPR/Cas系统存在脱靶效应、PAM位点识别范围有限等问题，限制了CRISPR/Cas的应用。为了解决这些问题，针对Cas蛋白进行工程化改造已经成为了优化及开发CRISPR/Cas系统的重要策略。本文以类CRISPR/Cas系统中靶向DNA的CRISPR/Cas9以及CRISPR/Cas12a为例，聚焦近年来针对Cas9和Cas12a蛋白的优化改造方法及相关进展进行系统阐述总结，包括Cas蛋白的工程化改造提升基因编辑特异性及改变PAM识别能力，以CRISPR/Cas系统作为基因定位工具开发新功能，结合外源蛋白调控CRISPR/Ca
3、s系统功能。这些工作开发了系列高特异性、高精度的CRISPR/Cas系统，极大地扩展了CRISPR/Cas系统的功能及适用范围，为CRISPR/Cas系统的多领域应用做出了重要贡献。关键词：CRISPR；Cas9；Cas12a；Cas 蛋白质工程；基因编辑中图分类号：Q812 文献标志码：A Protein engineering of DNA targeting type CRISPR/Cas systemsLIANG Liya，LIU Rongming（School of Bioengineering，Dalian University of Technology，Dalian 11602
4、4，Liaoning，China）Abstract:With different types of nucleases,genome editing technologies have opened up the possibility for targeting and modifying specific gene sequences,which show potential applications in basic and applied aspects of biotechnology research.Zinc-finger nucleases(ZFNs)and transcrip
5、tion activator-like effector nucleases(TALENs)are artificial proteins generated by fusing a specific DNA-binding domain with a restriction enzyme FokI DNA-cleavage domain,which arise from their ability to customize the DNA-binding domain for recognition of targeting sequences and cleaving them by th
6、e FokI domain.However,the design and construction of such a system are time consuming,laborious and costly.Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR associated(Cas)protein is a unique acquired immune system of bacteria or archaea.Since researchers constructed the CRISP
7、R/Cas 收稿日期：2022-07-18 修回日期：2022-09-28基金项目：国家自然科学基金（22278058，22208044）；大连理工大学基本科研业务费（DUT22RC（3）012，DUT22RC（3）013）引用本文：梁丽亚，刘嵘明.靶向DNA的类CRISPR/Cas系统的蛋白工程化改造 J.合成生物学，2023，4（1）：86-101Citation：LIANG Liya，LIU Rongming.Protein engineering of DNA targeting type CRISPR/Cas systems J.Synthetic Biology Journal，2
8、023，4（1）：86-101DOI:10.12211/2096-8280.2022-040特约评述第 4 卷 system for gene editing,its high efficiency has revolutionized a variety of fields such as life sciences,bioengineering,biomedicine,food,and agricultural sciences.However,the CRISPR/Cas system still has some challenges,such as off-target effect
9、 and limited PAM site recognition range,which limit its further applications.In order to solve these problems,molecular engineering of Cas proteins has become an important strategy for developing and optimizing CRISPR/Cas systems.In this study,with CRISPR/Cas9 and CRISPR/Cas12a selected as represent
10、ative examples for DNA-targeting Class II CRISPR/Cas systems,we focus on the optimization and modification methods,and progress of Cas9 and Cas12a proteins achieved within recent years,such as Cas protein engineering for improved on-target specificity and expanded PAM scopes,developing new functions
11、 using CRISPR/Cas systems as gene targeting tools,and introducing exogenous protein domains to regulate CRISPR/Cas functions.These studies have generated a series of high-specificity and high-precision CRISPR/Cas systems,which have greatly expanded their functions and scopes,and made important contr
12、ibutions to the wide-range applications of CRISPR/Cas systems.Keywords:CRISPR;Cas9;Cas12a;Cas protein engineering;gene editing开发精确、高效、通用的基因信息定制及操作技术是生物科学和生物技术的重要目标。以核酸酶为基础的基因编辑技术是一种新兴的能够精确地对生物体基因组靶向位点进行修饰的基因工程技术，与传统的基于同源重组的基因编辑工具相比，基因靶向率提高上万倍。基因编辑核酸酶主要分为4类：巨型核酸酶（meganuclease）1、锌指核酸酶（ZFNs）2、转录激活样效应因子
13、核酸酶（TALEN）3、成 簇 的 规 律 间 隔 的 短 回 文 重 复（CRISPR）和相关蛋白（Cas）4。其中，巨型核酸酶只能靶向识别特定的DNA序列（可达1240 bp），但特定序列限制了巨型核酸酶的靶向范围5。ZFNs和TALEN都是由DNA结合结构域和DNA切割结构域两部分组成6，通过模块化设计组装087合成生物学 第 4 卷DNA结合结构域，可以定制化对靶向位点进行识别、剪切，但是这两种工具的制备成本较高，合成时间相对较长6。与基于蛋白结合特定DNA序列的核酸酶 ZFNs、TALEN 相比，CRISPR/Cas 系统使用短RNA序列作为特异性识别元件，不仅具备了设计简单、成本低
14、廉、靶向范围广等优势，在微生物、植物、动物（包括人体）等生物体内也表现出了较高的通用性6。正是基于这种独特的功能机制，CRISPR/Cas系统迅速发展成为了新一代的基因编辑工具，目前被广泛应用于基因编辑7-8、基因转录调控9-11、碱基编辑12-13、基因成像14-15和表观遗传16-17等领域。由于 CRISPR/Cas系统对生物科学和生物技术发展的推动作用，2020 年度的诺贝尔化学奖颁发给了基于 CRISPR/Cas系统的基因编辑工具发明人Jennifer A.Doudna教授和Emmanuelle Charpentier教授。在过去几年中，科研人员对CRISPR/Cas系统进行了深入的
15、研究。在细菌和古细菌中发现了许多新的CRISPR/Cas系统，这些系统中Cas蛋白的结构和功能正在被阐明。CRISPR/Cas系统分为类和类，类系统代表 CRISPR-Cas 基因座的约90%，并且存在于不同的细菌和古菌门中。但是，由于类 CRISPR/Cas 系统是多蛋白复合体，由47个Cas蛋白亚基组成，因此不利于在不同宿主中进行高精度基因编辑。类CRISPR/Cas系统是多功能域组成的单蛋白，与类系统相比，类CRISPR/Cas 系 统 更 易 于 改 造。此 外，类CRISPR/Cas 系统能够通过 DNA 双链断裂（DNA double-strand breaks，DSBs）的方式切
16、割核酸序列。因此，基于类CRISPR/Cas系统的基因编辑工 具 开 发 更 为 广 泛，包 括 Cas9、Cas12a/b/c、Cas13a/b/c、Cas 及 Cas12k 等18-21。其 中 类CRISPR/Cas 系统中靶向 DNA 的代表性核酸酶是Cas9 和 Cas12a，它们都是由 nuclease（NUC）和recognition（REC）lobes组成的两叶结构（图1）。其中与 PAM 位点识别相关的结构域（PI、WED等）主要位于NUC lobe，与基因编辑特异性相关的结构域（REC3等）主要位于REC lobe（图1）。这两种核酸酶皆可作为单个Cas蛋白起到DNA识别、结合和切割的作用，通过合理设计或定向进化产生的Cas蛋白变体可以进一步提高Cas蛋白的高保真性能22-23。此外，Cas蛋白的蛋白质工程通常被用来改善CRISPR作为一种基因定位的工具。根据对Cas9及Cas12a核酸酶结构上的认知，通过对Cas蛋白关键位点进行定点突变，使Cas蛋白失去 DNA 剪切能力，而失活的 Cas 蛋白（dCas9 和dCas12a）仍然能够靶向结合目标位点，如果融合其他
