1、陈志峰倪辉冯翯等.基于 标记的单种属野鸦椿遗传变异和分化分析.亚热带农业研究():.():.收稿日期:基金项目:福建省科技厅社会发展引导性项目“鸡聆花(野鸦椿)药材规范化种植关键技术研究”()福建省科技厅高校产学研项目“野鸦椿遗传进化及观赏药用资源筛选”()遵义市科技计划项目“遵义娄山关地区濒危道地中药材资源保护与人工扶育研究”(遵市科合 字 号)遵义市优秀青年科技人才培养项目“遵义市野生蔬菜种质资源应用价值评价研究”(遵优青科 号)第一作者简介:陈志峰()男副教授博士 研究方向:园艺植物资源创新与应用:.通信作者邹双全()男研究员博士生导师 研究方向:森林培育与观赏药用植物:.基于 标记的单
2、种属野鸦椿遗传变异和分化分析陈志峰 倪 辉 冯 翯 陈 啸 蔡丽娟 孙维红 邹双全(.遵义师范学院贵州 遵义.福建农林大学林学院福建 福州.自然生物资源保育利用福建省高校工程研究中心福建 福州.福州外语外贸学院福建 福州)摘要:目的基于表型观测和单核苷酸多态性()分子标记探索单种属野鸦椿自然群体的遗传变异和分化为野鸦椿的保护和分子育种提供遗传资源和理论依据 方法在野鸦椿的典型分布区开展野外种质资源调查记录叶和果的表型收集嫩叶用于简化基因组测序 利用特异性位点扩增片段测序技术()挖掘多态性 位点基于高质量的位点计算遗传多样性参数、构建系统发育树进行主成分和群体结构分析 结果分子方差分析表明群体间
3、的遗传变异(.)比群体内的遗传变异(.)丰富 系统发育树、主成分分析和群体遗传的聚类模式一致将所有样品分为落叶类和常绿类 群体结构分析表明常绿类和落叶类之间缺乏基因交流()对各个群体的遗传分化指数()进行分析发现福建省的(.)、(.)、(.)等野鸦椿群体的分化程度高且这些群体同时存在落叶类和常绿类 野外观测发现落叶类和常绿类野鸦椿的物候、叶和果的表型具有明显差异 结论由于地理隔离、栖息地破碎化、基因交流受阻或缺乏等原因造成了野鸦椿群体内遗传多样性降低、群体间遗传分化程度高且已分化为落叶类和常绿类关键词:野鸦椿 遗传变异 遗传分化中图分类号:.文献标识码:文章编号:():./.(.):().亚热
4、带农业研究 第 卷 第 期 年 月 .().().(.)(.).().().(.)(.)(.).:野鸦椿属()为省沽油科()落叶灌木或小乔木仅野鸦椿(.)单个种主要分布在中国南部、日本和朝鲜是我国近年来快速发展的观赏植物和药用植物 野鸦椿挂果期长、果色鲜红、果成熟开裂似展翅蝴蝶在园林上可盆栽、孤植、列植或片植在我国福建、江西、贵州等地作为行道树、观赏树、药用林而被广泛种植 野鸦椿枝、叶和果均富含酚酸类、黄酮类、总三萜、生物碱等成分可用于治疗感冒、头晕、头痛等是我国民间的传统药材 目前对野鸦椿的研究主要集中于种质资源鉴定、种苗繁育、栽培、化合物分离与鉴定、药理活性等方面而忽略了野生资源的保护 了
5、解物种的遗传变异是制定科学保护策略的理论基础 野鸦椿自然群体主要分布于海拔 的山谷或林缘因受到人类活动的干扰导致天然群体面积和分布逐渐缩小再加上自然更新能力弱野鸦椿种质资源和遗传变异正在遭受威胁 因此了解野鸦椿的遗传变异可为其分类以及种质资源利用和制定保护策略等提供参考遗传变异是物种适应和进化的基础也是抵抗环境变化的重要保障 林木的遗传多样性越丰富则越能适应不断变化的环境和恶劣条件 单核苷酸多态性()是全基因组水平上由单个核苷酸碱基变异引起的 序列多态性可以检测基因组序列中每个核苷酸的变化具有数量多、分布广、代表性强、遗传稳定性好等特点是评价物种遗传背景最为理想的分子标记 特异性位点扩增片段测
6、序技术()能够大规模、快速、有效、准确地开发物种中的 尤其适用于没有参考基因组的物种 本研究利用 测序技术开发野鸦椿群体的 标记旨在从分子水平上揭示其遗传变异和分化了解现存野生种群的遗传背景及其对种群结构的影响为野鸦椿种群现状的评价和科学管理提供遗传学依据 材料与方法.取样与群体特征 年 月 年 月在野鸦椿果期开展野外调查收集了自然分布的 个种源共 份样品 年 月采集所有样品的嫩叶用体积分数为 酒精和纯水洗净经液氮处理后置于 冰箱中保存 样品取样信息详见表 年对全部样本进行物候观测详细记录各种源果和叶的表型.文库的构建和测序 测序包括样品质量检测、文库构建、文库质量检测和文库测序 使用改良的十
7、六烷基三甲基溴化铵法(法)提取叶片 以琼脂糖凝胶电泳检测和 紫外分光光度计(美国)分别检测 的纯度和浓度 质检合格的 用于 文库的亚 热 带 农 业 研 究第 卷构建表 野鸦椿的采样信息 .群体采集地数量/株经度纬度海拔/贵州省遵义习水自然保护区浙江省温州岱岭 江西省赣州赣县 福建省泉州德化 福州省三明泰宁 福建省邵武将石自然保护区福建省南平建瓯 福建省漳州南靖 福州省三明清流 福建省福州闽清 福建省龙岩连城 福建省三明永安 利用选定的 对检测合格的每个样品 进行酶切对得到的酶切片段进行 端加多聚腺苷酸 ()处理、连接 测序接头、扩增、纯化、混样、切胶选取 的目标序列定义为野鸦椿的 标签 文库
8、质检合格后在华大基因 平台进行测序下机的原始数据用于开发 标签和 分子标记.群体遗传结构和变异分析使用 软件中的邻接法()采用 模型 重复 次以省沽油()作为外类群构建进化树利用(././.)进行群体结构分析假设样本的分群数(值)为 当交叉验证错误率()最小时为最佳分类群数(.:/./)用于主成分分析 利用 .软件计算各群体和每对引物的观测等位基因数()、有效等位基因数()、观测杂合度()、期望杂合度()、多样性指数()、香农多样性指数()、多态性信息含量()、遗传分化指数()等遗传多样性参数 由于浙江省温州岱岭()和福建省漳州南靖()、福州闽清()、龙岩连城()等地采集到的野生野鸦椿个体数量
9、过少不进行遗传参数估算分析 结果与分析.标签和 开发对测序后的数据进行过滤共获得.干净数据平均测序深度为.的平均质量为.表明测序数据质量好可用于 标签的开发 对获取的数据进行聚类分析序列相似的定义为同一个 标签 在此基础上筛选样本间存在差异的 标签为多态性的 标签以深度最高的多态性 标签作为参考序列进而开发全基因组范围的 标记 根据次要等位基因频率()大于.和完整性大于.的原则筛选出高质量的 标记 本研究中基于 测序共获得 个 标签每个样品平均获得 个多态 标签和 个高质量的特异性 可用于野鸦椿遗传变异和分化的分析(表).群体变异由表 可知在物种水平上野鸦椿的 和 分别为.和.(.)小于 第
10、期陈志峰等:基于 标记的单种属野鸦椿遗传变异和分化分析(.)群体间的 和 分别在.().()和.().()之间除了 群体其他群体的 均小于(表)此外分子方差分析表明种群间的遗传变异占总变异的.(.)而群体内的遗传变异仅占总变异的.(.)(表)表 野鸦椿群体的 标签统计).群体干净序列/比例/含量/标签/个 .合计 平均 .)比例为碱基精确度.所占的百分比 含量为干净序列中 和 两种碱基占总碱基的百分比表 野鸦椿群体的遗传多样性指数分析).群体.物种水平.群体平均水平.).有效等位基因数.观测杂合度.期望杂合度.多样性指数.香农信息指数.多态信息含量表 分子方差分析 变异来源自由度平方和变异成分
11、变异百分比/群体间.群体内.遗传结构基于 构建的系统发育树表明以省沽油科的省沽油()为外类群所有野鸦椿样品分为两大类 聚类包含 个样本主要来自、等群体以及、(图)其余、等群体以及、则为聚类 结合 年的物候和表型观察发现聚类为落叶类花期 月果实期 月 月果皮变色 月果皮全红 月开始落叶掉果叶纸质或厚纸质叶缘具细锯齿果软革质果表皮肋脉明显(图、)而聚类为常绿类花期 月果实期 月 月果皮变色 月果皮全红果实可在枝头宿存直到次年 亚 热 带 农 业 研 究第 卷月叶膜质叶缘具钝锯齿果革质果表皮肋脉不明显(图、)蓝色框为常绿类野鸦椿橙色框为落叶类野鸦椿.系统发育树以省沽油()作为外类群、分别为常绿类野鸦
12、椿的表型叶膜质、边缘钝锯齿()圆锥聚伞花序()果革质、果表皮肋脉不明显()、分别为落叶野鸦椿的表型叶纸质或厚纸质、边缘有细锯齿()圆锥花序()果软革质、果表皮肋骨脉明显()图 基于 构建的野鸦椿系统发育树 .使用 软件构建了野鸦椿种群的群体结构(图)从图 可见当 时可以明显地看到落叶类和常绿类群体之间几乎不存在基因交流当 时落叶类和常绿类群体之间存在少量第 期陈志峰等:基于 标记的单种属野鸦椿遗传变异和分化分析的基因渐渗 但在图 中 时交叉验证错误率最低意味所有群体的最优分类为 组第 组和第 组样本为常绿类第 组样本(绿色)共有 个主要来自福建省的群体如、和 等群体第 组样本(黄色)有 个主要
13、来自江西省 群体第 组(灰色)为落叶类包含 个样本且这些样品与系统发育树中聚类的样本一致(图).群体结构点图.种群遗传的聚类图图 野鸦椿的遗传聚类 .图 基于 位点的主成分分析 主成分()分析发现省沽油()与野鸦椿明显分开野鸦椿所有样品主要分为 类与群体结构的结果完全相同 组中的样本与系统发育树中聚类和群体结构中第 组的一样 组和 组中的样本分别与群体结构中第 组和第 组的一致 由此可见 组是落叶类 组和 组是常绿类(图).遗传分化是 衡 量 群 体 间 分 化 程 度 的 一 个 指 标认为为.群体间遗传分化很小可以不考虑为.群体间存在中等程度的遗传分化为.群体间遗传分化较大为.以上群体间有
14、很大的遗传分化 分析各个群体的 值发现本研究群体间存在很大遗传分化的群体有(.)、(.)、(.)、(.)群体间存在中等程度遗传分化的群体有(.)、(.)群体(.)、(.)群体的分化程度小(表)另外综合表型观察、系统发育树、和群体结构的分析结果对野鸦椿落叶类和常绿类的样品进行 值分析发现落叶树和常绿树的 值分别为.和.表 各个群体的遗传分化指数分析)群体群体群体群体群体.常绿类.落叶类.)为群体间遗传分化指数 讨论利用简化基因组测序技术 获取大量多态性 标签进而开发特异性的 标记被广泛应用于遗传进化分析、关联分析、遗传图谱构建 本研究对野鸦椿自然分布区 个种亚 热 带 农 业 研 究第 卷源共
15、个样品进行 测序每个样品平均获得了 个多态性 标记与栎树()群体()、古茶树()群体()的平均 标记相近 基于高质量的 进行了野鸦椿遗传变异分析发现野鸦椿在物种水平上的 遗传多样性()和 多样性指数()分别为.和.比野生省沽油群体的遗传多样性指数(.)高但这并不能说明野鸦椿与同科的树种相比在物种水平上的遗传多样性更为丰富 因为本研究中野鸦椿的观测杂合度(.)远小于期望杂合度(.)这意味着野鸦椿中杂合子缺失群体遗传多样性水平较低据 记载野鸦椿属仅 种落叶灌木或小乔木树种即野鸦椿 通过对 个群体长达 的物候观察发现野鸦椿群体主要有落叶类和常绿类两大类型且它们的物候、叶和果的表型差异明显 本研究中系
16、统发育分析、遗传结构分析和主成分分析结果基本一致将所有野鸦椿样品主要分为落叶类和常绿类 地理隔离、栖息地破碎化、基因交流不频繁可以改变物种进化模式的方向影响其遗传变异导致种群内的遗传多样性低以及不同种群之间的分化程度高 对大多数木本植物而言群体内的遗传变异比群体间的遗传变异丰富而本研究中野鸦椿的群体间遗传变异(.)比群体内的丰富(.)且野鸦椿显著分化为落叶类和常绿类这暗示了在长期进化过程中某些因素推动了野鸦椿的分化地理隔离使得同一物种因地理障碍难以发生基因交流导致生殖隔离形成独立的种群 生境破碎化会导致遗传侵蚀、遗传漂变和近交引起杂合度降低使个体适应性下降最终抑制种群的持续野外调查发现、等群体
17、位于自然村落受到人类活动的干扰其群体数量小贵州省的 群体、浙江省的 群体和江西省的 群体与福建省内的群体地理相隔远群体间难以发生基因交流野鸦椿为兼性异交蜜蜂为主要传粉者但野外观测发现即使在同一群体内落叶类和常绿类野鸦椿的花期至少相差 个月导致落叶类和常绿类之间不可能存在基因交流遗传结构分析也证实落叶类和常绿类间几乎没有基因渗透、等群体的 值较高说明了落叶类和常绿类的同时存在是野鸦椿群体高度分化的结果 综上分析本研究推测地理隔离、栖息地破碎化、基因交流受阻或缺乏是野鸦椿群体内遗传多样性低、群体间分化程度高的原因 结论本研究观测了自然分布区 个野鸦椿种源的物候、花和果的表型并首次利用 对这些野生种
18、质进行测序挖掘了 个高质量的多态性 位点从分子层面分析了野鸦椿的遗传变异和分化 野鸦椿群体内遗传多样性低、群体间遗传分化程度高 多种分析方法表明单种属野鸦椿已经分化为落叶类和常绿类 落叶类的叶纸质或厚纸质、叶缘具细锯齿果软革质、果表皮肋脉明显而常绿类的叶膜质、叶缘具钝锯齿果革质、果表皮肋脉不明显参考文献 .:.汤良杰罗伟陈胡兰.野鸦椿属植物的化学成分及药理作用研究进展.林产化学与工业():.():.王俞岑.野鸦椿研究进展.现代园艺():.李悦.圆齿野鸦椿种质资源调查及不同种源家系的抗旱性研究.南昌:江西农业大学.():.第 期陈志峰等:基于 标记的单种属野鸦椿遗传变异和分化分析 刘芳马玉磊周慧
19、娟.基于种群多样性的自适应遗传算法优化仿真.计算机仿真():.刘济明管睿婷王敏等.不同喀斯特小生境中小蓬竹的遗传多样性.植物研究():.郑子洪周曼佳何祥玉等.分子标记技术在药用植物上的应用现状与金钱草的研究进展.农技服务():.:.():.田倩刘双委钮世辉等.基于 技术的白皮松 分子标记开发.北京林业大学学报():.:.():.():.():.何旭东郑纪伟教忠意等.基于 技术的舒玛栎群体遗传多样性与遗传结构分析.南京林业大学学报(自然科学版)():.耿广东陈立杰张素勤.基于 技术的古茶树 位点开发.经济林研究():.陈龙灿王颖王业中等.省沽油 引物筛选及居群遗传多样性初探.安徽农业大学学报():.李凤鸣张华新杨秀艳.省沽油群体遗传多样性的 分析.植物遗传资源学报():.:.():.宋雪梅杨九艳呼格吉乐图.破碎化生境对红砂 种群遗传多样性的影响.中国草地学报():.().():.().():.:.孙维红袁雪艳吴玲娇等.圆齿野鸦椿开花动态特征与繁育系统.植物生理学报():.(责任编辑:陈幼玉)亚 热 带 农 业 研 究第 卷
