1、山西农业科学 2023，51（9）：1088-1097Journal of Shanxi Agricultural Sciences基于响应面法优化贝莱斯芽孢杆菌 C44发酵参数马红珍 1，闫敏 2，李磊 3，杨治平 2，张家星 2，蒙秋霞 2，史向远 4（1.山西农业大学 资源环境学院，山西 太原 030031；2.山西农业大学 生态环境产业技术研究院，山西 太原 030031；3.山西农业大学 园艺学院，山西 太谷 030801；4.山西农业大学 山西有机旱作农业研究院，山西 太原 030031）摘要：对贝莱斯芽孢杆菌 C44发酵条件进行优化，可提高其菌落数和抗菌活性，为该菌株工业化生产提
2、供理论依据。以贝莱斯芽孢杆菌 C44为供试菌株，对培养基、氮源、碳源、无机盐、pH、温度、转速、装液量、接种量等因素进行单因素试验，研究其对 C44菌落数和抗菌活性的影响；并以此为基础，以菌落数为考察指标，通过 Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验和响应面试验等方法对其进行优化，选出菌落数生长最优发酵条件。单因素试验结果显示，LB培养基上贝莱斯芽孢杆菌 C44的菌落数和抑菌圈直径均最高，且明显高于其他培养基；C44菌落数和抑菌圈直径在以 10 g/L 胰蛋白胨为碳源、10 g/L 酵母提取物为氮源、10 g/L 磷酸氢二钠为无机盐、pH 值为 7.17.4、温度为 30、转速为 1
3、80 r/min、装液量为 100 mL、接种量为 5%的条件下达到最高。Plackett-Burman 试验从 8个影响因素中筛选出对菌落数生长影响极显著的因素为磷酸氢二钠、温度、转速，采用最陡爬坡设计和 Box-Behnken中心组合设计 3因素 3水平试验，得到对菌落数生长和繁殖影响最大的是磷酸氢二钠，其次是转速，温度影响最小。贝莱斯芽孢杆菌 C44发酵的最佳条件为：胰蛋白胨 10 g/L、酵母提取物 10 g/L、磷酸氢二钠 5.6 g/L、pH 值 7.3、温度 28.7、转速 172 r/min、装液量 100 mL、接种量 5%，在此条件下菌落数为 1.281011 cfu/mL
4、，较优化前提高了 10.1倍，同时还增强了抗病活性。关键词：贝莱斯芽孢杆菌；发酵；菌落数；Plackett-Burman；抗菌活性；响应面法中图分类号：TQ920.1 文献标识码：A 文章编号：10022481（2023）09108810Optimization of Fermentation Parameters of Bacillus velezensis C44 Based on Response Surface MethodologyMA Hongzhen1，YAN Min2，LI Lei3，YANG Zhiping2，ZHANG Jiaxing2，MENG Qiuxia2，SHI X
5、iangyuan4（1.College of Resources and Environment，Shanxi Agricultural University，Taiyuan 030031，China；2.Institute of Ecological Environment Industry Technology，Shanxi Agricultural University，Taiyuan 030031，China；3.College of Horticulture，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China；4.Shanxi Inst
6、itute of Organic Drought Farming，Shanxi Agricultural University，Taiyuan 030031，China）Abstract：Optimization of fermentation conditions of Bacillus velezensis C44 can increase its colony number and antibacterial activity,so as to provide a theoretical basis for the industrial production of Bacillus ve
7、lezensis C44.In this study,taking Bacillus velezensis C44 as the test strain,the effects of culture medium type,nitrogen source,carbon source,inorganic salt,pH,temperature,rotation speed,liquid volume,and inoculation size on the colony number and antibacterial activity of C44 were studied with singl
8、e factor test for the factors mentioned above.Using the colony number as the standard of evaluation,the fermentation conditions were then optimized through Plackett-Burman test,path of steepest ascent method and response surface methodology.The results of single factor test showed that the colony nu
9、mber and the inhibition zone diameter(IZD)of C44 grown on Luria-Bertani(LB)medium were the highest,significantly higher than those on other media.Using LB as basal medium,when the carbon source was 10 g/L of tryptone,nitrogen source was 10 g/L of yeast extract,inorganic salt was 10 g/L of disodium h
10、ydrogen phosphate pH was 7.1-7.4,temperature was 30,rotation speed was 180 r/min,liquid volume was 100 mL,and inoculation size was 5%,the colony number and IZD of C44 were the highest.In the Plackett-burman test,disodium doidoi:10.3969/j.issn.1002-2481.2023.09.14收稿日期：2023-01-12基金项目：山西省 1331工程项目（2021
11、1331-15）；山西省重点研发计划重点项目（201903D211002）；山西省农业科学院农业科技创新工程项目（YGC2019TD07）；山西农业大学“特”“优”农业高质量发展科技支撑工程课题（TYGC-37）；山西省现代农业产业技术体系建设专项（2021-11）作者简介：马红珍（1994-），女，陕西宝鸡人，助理研究员，硕士，主要从事生物有机肥研发及黄芪根腐病防治研究工作。通信作者：闫敏（1975-），女，河北深州人，副研究员，硕士，主要从事农业微生物、固体废弃物资源化利用、微生物肥料研究工作。1088马红珍等：基于响应面法优化贝莱斯芽孢杆菌 C44发酵参数hydrogen phospha
12、te,temperature,and rotational speed were identified as the factors that extremely significantly affected the colony number of C44.Path of steepest ascent method and Box-Behnken center combination design were applied to conduct a three-factor three-level test,and it was found that disodium hydrogen p
13、hosphate had the greatest influence on the colony growth and breeding of C44,followed by rotational speed,and temperature had the least influence.The optimal fermentation conditions of B.velezensis C44 were determined as 10 g/L of tryptone,10 g/L of yeast extract,5.6 g/L of disodium hydrogen phospha
14、te,pH 7.3,28.7,172 r/min,100 mL of liquid volume,5%of inoculation size.Under these conditions,the colony number was 1.281011 cfu/mL,which was 10.1 times higher than that before optimization.The optimized fermentation conditions also enhanced the antibacterial activity of C44.Key words：Bacillus velez
15、ensis;fermentation;colony number;Plackett-Burman;antibacterial activity;response surface methodology贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）能够产生多种生物活性物质，具有良好的生物学功能，在促进植物生长和防治植物真菌病害方面具有重要作用。相关研究表明，贝莱斯芽孢杆菌 FKM10 可以通过增加生物量、促进养分吸收、改善土壤肥力、改变土壤微生物群落结构等促进湖北海棠的生长1。多花黄精内生贝莱斯芽孢杆菌 ZJU-3 可产生多种植物激素2，发酵液中的脂肽粗提物能显著抑制尖孢镰刀菌菌丝的生
16、长，抑制率达到 51.6%，展现出较好的促生与抑菌效果。KIM 等3研究证实，贝莱斯 芽 孢 杆 菌 AK-0 对 真 菌 病 原 体 Colletotrichum gloeosporioides YCHH4 的菌丝生长具有较强的抑制作用，在田间条件下可有效防制苹果炭疽病。此外，贝莱斯芽孢杆菌还陆续被证实对黄瓜枯萎病菌、油菜菌核病菌、亚麻炭疽病菌、亚麻枯萎病菌、辣椒疫霉病菌、油茶炭痕病菌及马铃薯立枯病菌均有明显的抑制效果4，是一种极具应用前景的新型生防菌5-7。贝莱斯芽孢杆菌 C44 分离自浑源健康黄芪根际土壤中，对黄芪根腐病的主要致病菌尖孢镰刀菌8有较强的抗菌活性，有较大的应用需求与应用价值
17、。但有关贝莱斯芽孢杆菌的发酵研究尚少，发酵效果较差，要想将贝莱斯芽孢杆菌 C44 广泛生产并应用于环境中还需要对其发酵条件进行进一步优化。发酵培养基成分（碳源、氮源和无机盐等）和培养条件（温度、pH 和转速等）对微生物数量和抗菌活性强弱有很大的影响9-10。目前，在有关微生物发酵培养基与培养条件的优化方法中，报道最多的是采用响应面法。响应面分析法对工艺条件优化效果较好11-13，其中 Plackett-Burman 试验与 Box-Behnken 试验可用来判断试验因素及交互作用对目标响应值影响程度，准确表达因素对响应值的影响。通过中心组合试验，拟合得到二次多项式模型，从试验设计到结果表述，均
18、较为准确14。响应面法对试验设计进行了优化，以科学的方法来布置试验，并对试验结果进行处理，消耗最小的人力、物力，在最少的时间获得更多更好的生产15。因此，响应面法被广泛应用于微生物发酵过程的优化并取得了较好的效果，乔佳慧子等16使用响应面法优化萎缩芽孢杆菌 E20303 发酵培养基，优化后抑菌率由 51.15%提高至 72.51%；郭艳霞17等用响应面法对贝莱斯芽孢杆菌 YB19 产生中性蛋白酶的活力进行了发酵条件优化，使得其菌株产中性蛋白酶活力为 370.03 U/g。本研究将通过单因素试验与响应面法相结合，以微生物数量和抗菌活性物质为参考指标，优化贝莱斯芽孢杆菌 C44 发酵条件，使之高效
19、发酵，增加菌落数，同时增强抗菌活性，还尽可能地缩短贝莱斯芽孢杆菌菌株扩培周期，以期为该生防菌进一步扩大培养提供一定的帮助。1 材料和方法1.1试验材料供试菌株为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）C44 和黄芪根腐病菌尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum），均由山西农业大学生态环境产业技术研究院实验室保存。供试基础培养基18有 LB培养基、SOB培养基、YPD培养基、NB培养基、NBG培养基。主要试剂有胰蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物（生物试剂，北京奥博星生物技术有限责任公司）；氯化钠、磷酸氢二钠、氯化钾（分析纯，天津市北辰方正试剂厂）；蔗糖、乳糖、葡萄糖（分析纯，
20、天津市科密欧化学试剂有限公司）；硫酸铵（分析纯，天津市致远化学试剂有限公司）；磷酸氢二钾（分析纯，天津市北辰方正试剂厂）；硫酸镁、硫酸锰（分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司）；氯化钙（分析纯，天津市兴复科技发展有限公司）。1089山西农业科学 2023 年第 51 卷第 9 期1.2试验方法1.2.1菌落数与抗菌活性测定1.2.1.1菌落数测定用菌落计数法19，取贝莱斯芽孢杆菌发酵菌液 1 mL 加入 9 mL 无菌试管水中，充分振摇，梯度稀释到 1.0107倍，然后将 100 L稀释液吸入牛肉膏蛋白胨平板（NA）中，涂匀后在30 C下培养 48 h，对 NA 培养平板上的菌落数进行统计并重复
21、 3次。1.2.1.2 抗 菌 活 性 测 定 用 双 层 平 板 法 进 行 研究20，将发酵好的菌液于 10 000 r/min离心 25 min，取上清液，过滤（0.22 L 滤膜）备用。将琼脂培养基 10 mL 注入培养皿内，放置在水平面上，待其凝固，再取孢子浓度 1.0106 cfu/mL 尖孢镰刀菌菌悬液，在熔化 50 C 左右 PDA 培养基里混合，二者液体之比为 1 10，混合液倒入上述凝固培养皿内5 mL，放在水平台面固化。将无菌牛津杯竖直放置于双层检测平板之上，添加 200 L 的贝莱斯芽孢杆菌待测液进行试验，置于培养箱内，培养 72 h，测抑菌圈的直径并重复 3次。1.2
22、.2培养基与发酵条件优化1.2.2.1基础培养基筛选将活化后的 C44 菌株在 NB 液体培养基中接种，于 30 C、180 r/min 条件下振荡培养 18 h为种子液。基础培养的条件为：转速 180 r/min、培养温度 30、接种量体积比为 3%、装液量体积比为 40%、培养时间 24 h。在 5 种供试基础培养基上，接种上述培养液 3%，按照上述基本培养条件发酵。再取液体发酵液，统计菌落数，检测发酵液抗菌活性，以筛选出最适基础培养基。1.2.2.2发酵培养基组成优化采用 1.2.2.1 发酵培养条件，改变发酵培养基组成，24 h 后按照 1.2.1测定发酵液菌落数和抑菌圈大小，筛选出最
23、佳发酵培养基组成，每个处理重复 3 次，具体培养基组成设定如下。碳源组分和质量浓度：分别用蔗糖（Su）、乳糖（La）、葡萄糖（Gl）、麦芽糖（Ma）、甘露醇（Mn）、可溶性淀粉（Ss）替换 1.2.2.1 优选基础培养基 LB 中的胰蛋白胨（Tr），其他组分不变，筛选出最佳碳源组分。在最佳碳源组分基础上，设置最佳碳源的质量浓度分别为 5、10、15、20 g/L 处理，其他组分不变，筛选出最佳碳源质量浓度。氮源组分和浓度：LB 为基础培养基，分别用尿素（Ur）、牛肉膏（BE）、硫酸铵（AS）、硝酸铵（AN）、麸皮（Br）替换 LB 基础培养基中的酵母提取物（YE），基础培养基中的其他组分不变，
24、筛选出最佳氮源。在最佳氮源基础上，改变培养基中最佳氮源的质量浓度（5、10、15、20 g/L），基础培养基中的其他组分不变，筛选出最佳氮源质量浓度。无机盐组分和质量浓度：LB为基础培养基，分别用氯化钾（PC）、磷酸氢二钾（DH）、磷酸氢二钠（DP）、硫酸镁（MS）、硫酸锰（MG）、氯化钙（CC）替换 LB 基础培养基中的氯化钠（SC），基础培养基中的其他组分不变，筛选出最佳无机盐。在最佳无机盐基础上，改变培养基中最佳无机盐的质量浓度（5、10、15、20 g/L），基础培养基中的其他组分不变，筛选出最佳无机盐质量浓度。1.2.2.3发酵培养条件优化在 1.2.2.2优化的 LB培养基上，改变
25、发酵条件，24 h 后按照 1.2.1 测定发酵液菌落数和抑菌圈大小，筛选出最佳发酵条件，每个处理重复 3次，具体发酵条件设置如下。pH 值：设初始 pH 值为 5、6、7、8、9，复筛 pH 值为 7.1、7.2、7.3、7.4、7.5；培养温度为 25、30、35；转速为 150、180、210 r/min；250 mL 体积装液量为50、100、150、200 mL；接种量为 1%、3%、5%、7%。1.2.3响应面试验1.2.3.1Plackett-Burman 试验为确定影响 C44菌株菌落数较显著的发酵参数，基于单因素试验结果，使用 Design-Expert.V 8.0.6.1
26、对胰蛋白胨添加量、酵母提取物添加量、磷酸氢二钠添加量、初始 pH 值、温度、转速、装液量、接种量等 8 个发酵参数设计 Plackett-Burman 试验（N=12 的 8 因素 2水平）。以菌落数为响应值，每个处理重复 3次，取平均值为响应值。各因素对应因子编码如表 1所示。1.2.3.2最陡爬坡试验基于 Plackett-Burman 试表 1 Plackett-Burman试验设计的因素水平和编码Tab.1 Factors，levels，and codes of Plackett-Burman experimental design因素Factor胰蛋白胨质量浓度/（g/L）Trypt
27、one concentration酵母提取物质量浓度/（g/L）Yeast extract concentration磷酸氢二钠质量浓度/（g/L）Disodium hydrogen phosphate concentration初始 pHInitial pH温度/Temperature转速/（r/min）Rotate speed装液量/mLLoaded liquid接种量/%Inoculum size编码CodeABCDEFGH水平Level-15557.22515050311515157.43521015071090马红珍等：基于响应面法优化贝莱斯芽孢杆菌 C44发酵参数验结果，通过方差分
28、析，发现对菌落数有显著影响的 3个因子，综合考虑每个因子效应的正负以及试验成本，设计最陡爬坡试验中每个因子的步长以及爬坡方向。1.2.3.3Box-Behnken试验基于Plackett-Burman试 验 和 最 陡 爬 坡 试 验 结 果，利 用 软 件 Design-Expert.V8.0.6.1 对 N=17 的 3 因 素 3 水 平 Box-Behnken试验进行设计，自变量为磷酸氢二钠（A）、温度（B）及转速（C）的 3 组平行试验并进行数据分析，结果如表 2所示。2 结果与分析2.1培养基的筛选由图 1 可知，在 LB 培养基中，贝莱斯芽孢杆菌 C44 菌落数、抑菌圈直径均明显
29、大于其他培养基（P0.05），分别为 1.271010 cfu/mL 和 13 mm，比NB处理中的菌落数和拮抗活性分别高出533.3%和 550.0%，表明 LB 培养基对贝莱斯芽孢杆菌生长较为有利，抑菌物质较多。故在后续优化试验中，以 LB 培养基作为本菌株的基础培养基。2.2培养基组成优化不同碳源对菌株 C44 菌落数和活性的影响如图 2-A 所示，在供试的 7 种碳源中，Tr 处理的菌落数和抑菌圈直径最高，分别为 1.271010 cfu/mL 和13.3 mm，菌 落 数 比 其 他 处 理 分 别 高 出 111.1%、40.7%、81.0%、442.9%、26.7%、18.8%，
30、Ma 的菌落数和抗菌活性最低。由 图 2-B 可 知，Tr 的 质 量 浓 度 为 510 g/L时，菌落数和抗菌活性逐渐升高；Tr的质量浓度为1015 g/L 时，菌株 C44的菌落数和抗菌活性逐渐降低；Tr的质量浓度为 1520 g/L 时，菌株 C44的菌落数和抗菌活性变化不大，这可能是大量的 Tr使贝莱斯芽孢杆菌 C44 菌体快速增长的同时也增加了代谢产物的积累，一些有害代谢产物会抑制菌体的生长繁殖。因此，确定 Tr 的最佳质量浓度为 10 g/L。不同氮源对菌株 C44 菌落数和活性的影响如图 2-C 所示，在供试的 6种氮源中，YE 处理的菌落数和抑菌圈直径最高，分别为 1.681
31、010 cfu/mL 和13.7 mm，其菌落数分别比其他处理高出 215.6%、32.9%、288.5%、1 583.3%、1 583.3%，而 Ur 和 BE则不利于菌株 C44 的生长繁殖，菌落数和抗菌活性均较低。从图 2-D 可以看出，YE 的质量浓度为510 g/L 时，菌落数和抗菌活性逐渐升高；YE 的质量浓度为 1015 g/L 时，菌落数和抗菌活性逐渐降低，YE 的质量浓度为 1520 g/L 时，菌落数和抗菌活性变化不大，说明高质量浓度的 YE 不利于菌株 C44 的繁殖生长。故 YE 的最佳质量浓度为 10 g/L。无机盐不仅是组成菌体细胞最主要的营养成分之一，同时，它还是
32、酶的组成部分、酶激活剂或者抑制剂，对培养基渗透压、pH、氧化还原电位等有调节作用。不同无机盐对菌株 C44 菌落数和活性的影响如图 2-E 所示，在供试的 7 种无机盐中，DP和 MS 处理的菌落数和抑菌圈直径均较高，其中DP 的菌落数和抑菌圈直径最高，分别为 2.271010 cfu/mL 和 14.6 mm，而 CC 处理的菌落数和抗菌活性最低。从图2-F可以看出，DP的质量浓度为510 g/L时，菌落数和抗菌活性逐渐升高；DP的质量浓度为1025 g/L 时，菌落数和抗菌活性逐渐下降，说明高质量浓度的 DP会抑制 C44菌体的繁殖。故确定DP的最佳质量浓度为 10 g/L。表 2 Box
33、-Behnken试验设计的因素水平和编码Tab.2 Factors，levels，and codes of Box-Behnken experimental design因素Factor磷酸氢二钠质量浓度/（g/L）Disodium hydrogen phosphate温度/Temperature转速/（r/min）Rotation speed编码CodeABC水平 Level-15261600102817011530180图 1基础培养基对 C44菌株菌落数和抑菌圈的影响Fig.1Effect of basal medium on colony number and inhibition z
34、one of C44 strain.1091山西农业科学 2023 年第 51 卷第 9 期2.3发酵条件的优化由图 3-A 可知，初筛过程中，随培养基 pH 值升高，菌株 C44菌落数增大，活性提高，在 pH 值为 78 时，对菌株生长最为有利，其中，pH 值在 7 时，菌落数和抑菌圈直径都达到最大值，分别为 2.431010 cfu/mL 和 14.7 mm，之 后 则 显 著 下 降（P0.05）。为确定最佳 pH 值，依次对 pH 值为 7.1、7.2、7.3、7.4、7.5进行复筛，从图 3-B 可以看出，pH 值为7.17.3时，菌株 C44菌落数增大，活性提高，在 pH值为 7.
35、3时，菌落数和抑菌圈直径最高；从抑菌圈直径来看，pH 值为 7.17.4 时均较高，pH 值为 7.4 之后逐渐下降。结合菌株 C44菌落数与抑菌活性，将7.27.3确定为贝莱斯芽孢杆菌最适宜 pH值。温度对确保酶活性至关重要，同时也影响着细胞膜流动性及发酵液内物质溶解度，温度偏低和偏高都会抑制菌株 C44的繁殖生长。如图 3-C 所示，30 下菌落数和拮抗活性最高，菌落数和抑菌圈直径分别为2.971010 cfu/mL和16.0 mm，比25、35 处理分别高出 81.6%、53.5%和 20.9%、12.9%。故确定 30 为最佳温度。由图 3-D 可知，当转速为 150180 r/min
36、 时，随着转速的升高，C44 菌落数明显增加，抑菌活性逐渐增强，180 r/min 转速时菌落数和抑菌活性最高，分别为 3.391010 cfu/mL 和 17.5 mm；此后菌落数及抑菌活性随转速升高而下降，表明当转速超过 180 r/min后，其对贝莱斯芽孢杆菌生长繁殖会造成一定程度的障碍。故选择最佳转速为180 r/min。从图 3-E 可以看出，装液量在 50100 mL 时，C44 菌株随着装液量增加菌落数和抑菌活性逐渐升高，并在 100 mL 时的菌落数和抑菌圈直径达最大，分别为 3.631010 cfu/mL 和 17.9 mm；装液量为 100200 mL 时，菌株菌落数和抑菌
37、活性随着装液量增加逐渐降低，因为装液量越大，营养物质越多，菌株生长会越好，就会导致耗氧量增加，这必然图 2不同营养成分对 C44菌株菌落数和抑菌圈的影响Fig.2Effects of different nutrients on colony number and inhibition zone of C44 strain1092马红珍等：基于响应面法优化贝莱斯芽孢杆菌 C44发酵参数会影响菌株的生长代谢。故选 100 mL 为最佳装液量。接种量太低，会延长发酵周期，菌株繁殖生长峰值推迟，接种量过大会使培养基内有限营养物质消耗加快，缩短周期。由图 3-F 可知，接种量为1%5%时，菌株的菌落数
38、和抑菌活性逐渐升高，当接种量为 5%时，C44 菌落数和抑菌圈直径为最大，分别为 3.871010 cfu/mL 和 18.3 mm；接种量为 5%7%时，菌株的菌落数和抑菌活性逐渐降低。故选 5%为最佳接种量。2.4基于响应面法对发酵条件优化2.4.1Plackett-Burman 试验结果根据单因素试验结果，确定研究因素和水平后，按照表 1 对发酵条件中 8种因素进行考察，对试验设计得出的结果进行方差分析，以筛选出对菌落数影响显著的因素作进一步优化。由表 3 可知，Plackett-Burman 试验模型 R2=0.983 5，P 值为 0.013 5、低于 0.05，说明此模型有统计学意
39、义。由各因子 P 值可知，DP、温度、转速和胰蛋白胨对菌落数的值影响极显著（P0.05），从极显著因素中选出 3个 P值最小的因素进行后续试验。根据表 3的各因素预估系数（系数为正表示正效应，需对试验设计的试剂用量梯度增加；系数为负表示负效应，需对试验设计的试剂用量梯度减少）可知，DP、温度、转速对菌落数的值均表现为正效应。因此，根据 P 值和因素的正效应进行下一步的最陡爬坡试验。图 3不同发酵条件对 C44菌株菌落数和抑菌圈的影响Fig.3Effects of different fermentation conditions on colony number and inhibition
40、zone of C44 strain1093山西农业科学 2023 年第 51 卷第 9 期2.4.2最陡爬坡试验结果依据表 3 的 Plackett-Burman试验方差分析因子的正负效应，并结合实际情况，确定了爬坡试验中因子的爬坡方向及步长，其具体设计与结果如表 4所示。由表 4可知，第 2组试验菌落数最高，为 7.9331010 cfu/mL，故以此为试验的水平中心进行后续响应面试验与分析。2.4.3 响 应 面 试 验 根 据 Plackett-Burman 试 验和最陡爬坡试验结果，以菌落数为响应值，以 DP 10 g/L、温度 28、转速 170 r/min 为中心点，对Box-B
41、ehnken 试验设计的结果建立回归模型并进行方差分析，结果如表 5所示。表 3 Plackett-Burman 试验方差分析Tab.3 Variance analysis of Plackett-Burman test来源Source模型Model胰蛋白胨（A）Tryptone酵母提取物（B）Yeast extractDP（C）pH（D）温度（E）Temperature转速（F）Rotation speed装液量（G）Liquid volume接种量（H）Inoculation size差数Difference总和Total预估系数Estimated coefficient18.42-2.0
42、81.032.19-0.192.362.58-0.250.25平方和Quadratic sum271.5352.1312.6757.770.4566.8880.140.750.754.56276.09df811111111311均方Mean square33.9452.1312.6757.770.4566.8880.140.750.751.52F值F value22.3134.268.3337.970.3043.9652.670.490.49P值P value0.013 50.009 90.063 20.008 60.623 50.007 00.005 40.534 50.534 5表 4 最
43、陡爬坡试验设计及结果Tab.4 The steepest ascent experiment design试验编号Number12345DP/（g/L）Disodium hydrogen phosphate510152025温度/Temperature2628303234转速/（r/min）Rotation speed160170180190200菌落数/（1010 cfu/mL）Colony number6.0677.37b7.9338.62a4.6003.61c3.8001.00c1.5670.58d注：采用 LSD进行多重比较，同列数据后的不同小写字母表示差异显著（P0.05）。Note
44、:Using LSD multiple comparisons,different lowercase letters in the same column indicated significant difference(P0.05).表 5 响应面试验方差分析Tab.5 Variance Analysis of response surface test来源Source模型ModelDP（A）温度（B）Temperature转速（C）Rotation speedABACBCA2B2C2残差Residual失拟项Lack of fit净误差Net error总误差Total error平方和
45、Quadratic sum3 473.741 300.5072.00220.502.2556.2556.2547.961 094.80569.0158.5040.5018.003 532.24df911111111173416均方Mean square3 473.741 300.5072.00220.502.2556.2556.2547.961 094.80569.018.3613.504.50F值F value46.18155.628.6226.380.276.736.735.74131.0068.093.00P值P value0.000 10.000 10.021 90.001 30.61
46、9 80.035 70.035 70.047 80.000 10.000 10.158 11094马红珍等：基于响应面法优化贝莱斯芽孢杆菌 C44发酵参数方差分析结果显示，所选择的回归模型 P0.05，不显著，回归模型拟合度较高，能充分解释试验因子和响应变量的函数关系。菌落数值（Y）对 DP（A）、温度（B）、转速（C）的多元二次回归 方 程 为：Y=123.0012.75A+3.00B5.25C+0.75AB 3.75AC+3.75BC+3.37A2 16.13B211.62C2。由 4 图可知，当磷酸氢二钠一定时，菌落数随转速的升高而逐渐升高，达到某一转速后菌落数开始呈现下降趋势；在一定转
47、速下菌落数随磷酸氢二钠含量升高而降低。当磷酸氢二钠用量一定时，菌落数随温度升高而逐渐升高，达到某一温度后，菌落数开始慢慢下降；在一定的温度范围，高温较低温更有利于菌落的生长；当温度一定时，随着磷酸氢二钠的增加，菌落数呈逐渐下降趋势。当温度一定时，菌落数随转速升高表现为先升高后降低；当转速一定时，菌落数随温度升高有个上升过程，温度约 28 C菌落数达到最大值，然后开始下降。通过构建的响应面模型，实现了参数最优化分析，结果表明，贝莱斯芽孢杆菌菌落数最多时，其 最 佳 培 养 条 件 为：磷 酸 氢 二 钠 5.6 g/L、温 度28.7 C、转速 172 r/min。为验证响应面试验所得结果的可靠
48、性，对通过响应面试验得出的最佳发酵条件进行 3 次平行试验，测得 C44 菌落数为 1.281011 cfu/mL，与预测值 1.351011 cfu/mL 相当接近。因此，得到的模型能够较好预测实际 C44菌株的菌落数，响应面法适用于贝莱斯芽孢杆菌菌落数研究。3 结论与讨论本研究以单因素为基础，采用响应面法筛选得到了贝莱斯芽孢杆菌 C44 的最佳发酵培养基及发酵条件，结果表明，生防菌生产发酵效率及抗菌物质生产与培养基组分和发酵条件都密切相关21。图 4磷酸氢二钠、温度和转速三者交互作用对贝拉斯芽孢杆菌 C44生长影响的响应面Fig.4Response surface of interacti
49、ons among disodium hydrogen phosphate，temperature，and rotation speed on the growth of Bacillus velezensis C441095山西农业科学 2023 年第 51 卷第 9 期李姝江等18和武天上等22先后对贝莱斯芽孢杆菌ZJ20菌株、CC0955菌株等进行优化研究，但得到的培养基成分和发酵条件都不一致，说明不同贝莱斯芽孢杆菌在不同环境中受温度、培养条件等外界因素的影响下对营养成分的需求存在差异。本 研 究 以 LB 为 基 础 培 养 基，选 定 Plackett-Burman试验得到的 3个主
50、要影响因子磷酸氢二钠、温度、转速为自变量，以菌落数作为响应值进行了分析，所得因素对菌落数影响程度大小依次是磷酸氢二钠转速温度。其中磷酸氢二钠与转速以及温度与转速之间交互作用大于磷酸氢二钠与温度交互作用。研究认为，贝莱斯芽孢杆菌菌落数最多时，其最佳培养条件：磷酸氢二钠为 5.6 g/L、温度为28.7 C、转速为 172 r/min，并对所得贝莱斯芽孢杆菌 C44菌株的优化发酵条件加以验证，试验得到的C44 菌落数为 1.281011 cfu/mL，与预测值具有较好的一致性，表明该模型是有效的。这与曹可可等23、李冰等24的研究结果相似，均反映出响应面法可提高试验效率，优化菌量，降低成本等。本研
