1、2023 第二十五卷 第三期 Vol.25 No.3 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 健脾合剂调控miRNA-219a-5p、miRNA-338-3p干预IBS-D大鼠的作用机制研究丁姮月1，王萌1，2，杨欣2，3，梁国强1，吴婷婷1，2，张培培1，2，孙宏文1（1.南京中医药大学附属苏州市中医医院 苏州 215009；2.南京中医药大学研究生院 南京 210023；3.南京医科大学附属苏州科技城医院 苏州 215153）摘要：目的基于 m
2、iRNA-219a-5p、miRNA-338-3p 探讨健脾合剂干预腹泻型肠易激综合征（Diarrhea-predominant irritable bowel syndrome，IBS-D）大鼠的作用机制。方法采用急-慢应激法联合番泻叶灌胃法制备IBS-D大鼠模型，分组后给予健脾合剂干预。实验过程中及治疗完成后，记录大鼠一般情况、体质量及粪便性状；采用直肠扩张下腹壁回缩反射（Abdominal withdrawal reflex，AWR）评分检测大鼠的疼痛阈值，评估IBS-D大鼠的内脏敏感性；采用显色基质鲎试剂检测大鼠血液中的细菌内毒素含量，观察其肠道通透性变化；观察大鼠结肠黏膜组织病理，对
3、其肠黏膜状态进行评估；并使用RT-PCR法检测大鼠结肠黏膜miR-219a-5p、miR-338-3p的含量。结果粪便性状评分、内脏敏感性测定、组织病理结果表明IBS-D大鼠模型制备成功。与空白组比较，模型组大鼠大便稀溏甚则水样，体质量下降；健脾合剂治疗后，低剂量组及高剂量组大鼠大便成形，粪便Bristol评分显著降低，体质量有所增加。内脏敏感性结果显示，IBS-D大鼠内脏疼痛阈值下降；健脾合剂干预后，低剂量组及高剂量组大鼠内脏疼痛阈值有所升高，内脏敏感性降低。显色基质鲎试剂检测结果显示，IBS-D大鼠血清内毒素含量升高；健脾合剂干预后，低剂量组及高剂量组大鼠内毒素含量较前下降，肠道通透性降低
4、。大鼠结肠粘膜病理结果表明，IBS-D大鼠结肠组织黏膜上皮轻度破损，局部可见水肿。健脾合剂治疗后，低剂量组及高剂量组大鼠结肠黏膜上述情况得到有效改善。Real-time PCR法检测大鼠结肠粘膜结果显示，IBS-D大鼠结肠黏膜miR-219a-5p、miR-338-3p水平显著降低，健脾合剂治疗后，高剂量组大鼠miR-219a-5p、miR-338-3p含量有所升高。结论健脾合剂对改善IBS-D症状具有一定的作用，健脾合剂能够增加IBS-D大鼠结肠黏膜miR-219a-5p、miR-338-3p水平，提示其可能通过对miR-219a-5p、miR-338-3p的调控降低IBS-D大鼠的肠道通透
5、性及内脏敏感性，从而发挥疗效。关键词：腹泻型肠易激综合征 健脾合剂 miRNA-219a-5p miRNA-338-3p 直肠扩张下腹壁回缩反射 细菌内毒素doi:10.11842/wst.20220303004 中图分类号:R285.5 文献标识码:A肠易激综合征（Irritable bowel syndrome，IBS）是一种功能性肠病，其以腹痛、腹胀、排便习惯及粪便性状改变为典型特征。按照粪便性状IBS被分为腹泻型、便秘型、混合型和不定型4种临床类型，我国以腹泻型肠 易 激 综 合 征（Diarrhea-predominant irritable bowel syndrome，IBS-D
6、）多见1。该病发病率较高，严重影响患者的生活质量与情绪状态。目前，IBS-D发病机制尚未完全明确，肠道低度慢性炎症、免疫功能障碍、内 收稿日期：2022-03-03 修回日期：2022-04-19 苏州市科学技术局、市卫生局面上项目（KJXW2021045）：探讨健脾合剂调控miRNA-219a-5p、miRNA-338-3p干预IBS-D大鼠的作用机制，负责人：丁姮月；苏州市科学技术局面上项目（SYS201777）：脾虚型IBS-D肠道微生物的变化及健脾合剂的干预研究，负责人：孙宏文；国家中医药管理局面上项目（201962）：吴门医派杂病流派传承工作室项目，负责人：葛惠男。通讯作者：孙宏文，
7、主任中医师，教授，博士生导师，主要研究方向：脾胃病的中西医结合诊治。1102 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中医药与肝肠疾病研究脏高敏感性、肠道菌群失调等被认为是该疾病的主要发病因素2。西医治疗方面，IBS-D多以解痉剂、止泻剂、抗抑郁药物、益生菌为主，其药物存在有效性和安全性的限制，只能在一定程度上起作用3。中医方面，结合吴门医派学术思想，我院临床长期运用健脾法，使用院内制剂健脾合剂对IBS-D患者进行治疗，显
8、著改善患者的症状，长期服用取得满意疗效，值得临床推荐4。课题组前期临床研究、动物实验及预实验发现4-8，健脾合剂能够恢复IBS-D患者及小鼠肠道菌群的动态平衡，增加有益菌丰度、降低有害菌丰度，降低小鼠白细胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）水平，增加小鼠紧密连接蛋白（Claudin-1）表达，提示健脾合剂在调节菌群、抗炎和改善肠粘膜屏障方面有作用，且能明显改善患者及小鼠的主要症状，疗效显著。但健脾合剂的具体作用机制有待进一步探讨。近5年来，大量证据表明微小核糖核酸（miRNAs）的改变可能是 IBS 发病机制中的重要促发因素9-10。研究发现11，IBS 患者结肠黏膜的 miRN
9、A-219a-5p、miRNA-338-3p 水平降低。通过进一步实验表明，miRNA-219a-5p的下降导致了肠道通透性的增加，从而破坏肠道屏障功能，促使IBS的发生。miRNA-338-3p的减少则通过丝裂原活化蛋白激酶途径在内脏高敏感中发挥作用，导致IBS患者出现腹痛、腹胀等症状。故本研究以IBS-D大鼠为研究对象，分析其使用健脾合剂后肠道通透性、内脏敏感性的变化；观察大鼠结肠黏膜组织病理，对其肠黏膜状态进行评估；并使用RT-PCR法检测大鼠结肠黏膜miR-219a-5p、miR-338-3p的含量，研究健脾合剂对IBS-D大鼠miRNA-219a-5p、miRNA-338-3p的干预
10、效果，探究健脾合剂通过调控miRNA-219a-5p、miRNA-338-3p 干预 IBS-D 大鼠的具体作用机制，为进一步开发和推广传统医学提供基础研究证据，也为临床应用打下坚实的基础。1 材料 1.1实验动物雄性 SD 大鼠 32 只，SPF 级，4 周龄，体质量 18010 g，温度 18-26，相对湿度 40%-70%，标准普通饲料喂养3天适应实验环境。相关动物实验都已通过苏州市中医医院动物伦理委员会批准。伦理批件号：2021伦动批070。1.2药物与试剂番泻叶（批号201219）；健脾合剂（批号200705）：党参，炒白术，茯苓，炙甘草，炒陈皮，炒山药；健脾合剂组成见表1，指纹图谱
11、4见图1。上述饮片均由苏州市春晖堂药业有限公司供应，符合2020年 中国药典规范。石蜡油（泰兴科学仪器经营部，批号20120702-2）；内毒素试剂盒（厦门鲎试剂生物科技股份有限公司，批号21100203）；样本处理液（厦门鲎试剂生物科技股份有限公司，批号20068111）；血液抗凝剂（厦门鲎试剂生物科技股份有限公司，批号20068112）；戊巴比妥（pentobarbital，美国sigma公司，批号20089104）；HE染色液；生理盐水（上海百特医疗用品有限公司）；Trizol（invitrogen，批号1596-026）；氯仿（国药集团，批号 10023419）；异丙醇（国药集团，批号
12、 80109218）；PCR 试剂盒（Thermo，批号#K0223）；逆转录试剂盒（Fermentas，批号#K1622）等。1.3仪器低温冷冻离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司，型号TG-16M）；移液枪（吉尔森P型移液器公司，型号 P2、P10、P20、P100、P200、P1000）；电动匀浆机（天根，型号OXE-Y20）；Real-time检测仪（ABI公司，型号ABI-7300）；玻璃试管（厦门鲎试剂生物科技股份有限公司，批号21037014）；离心管、枪头等常规耗材（国产）等。2 方法 2.1IBS-D模型的制备32 只雄性 SD 大鼠，SPF 级，4 周龄，体质量 18010
13、 g，标准普通饲料喂养3天适应实验环境，随机选取8只大鼠作为正常对照组。其余24只大鼠使用急-慢应激法联合番泻叶灌胃法12-13建立IBS-D模型。急-慢应激法：给予大鼠以下刺激：夹尾1 min；水平震动（每分钟120次），持续40 min；夜间连续照明12 h，45闷热环境中5 min；剥夺食物1天；禁水1天，4寒冷环境中3 min。每周按照随机顺序给予模型大鼠上述刺激，每连续2天给予的刺激顺序不能重复，连续3周，再休息1周，在第4周最后1天，束缚大鼠胸部、前肩、前上肢，限制前上肢搔抓头面部，时间1 h。并从第23天开始进行番泻叶灌胃：采用水提法提取番泻叶有效成分。准确称取番泻叶饮片2 kg
14、，加冷水3倍浸泡30 min左右，煮沸后再煎30 min，随后过滤取汁3000 mL；余下1103 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第三期 Vol.25 No.3 的饮片再加水3000 mL煎半小时过滤取汁，两次相兑并浓缩成每毫升1 g生药的煎剂2000 mL保存于4冰箱中。然后通过水浴将 100%番泻叶煎剂加热至25，以10 mLkg-1大鼠体积以灌胃法给予24只大鼠，每天2次，连续5天，制定IBS-D模型。每日观察
15、大鼠的全身毛发、精神状态、进食饮水、活动性及粪便性状等情况。2.2动物分组与给药方法造模成功后，将模型大鼠随机分成模型对照组、健脾合剂低剂量组、健脾合剂高剂量组，每组8只；另8只设为空白对照组。各给药组按 10 mLkg-1灌胃给药，给药剂量为健脾合剂低剂量组2.52 gkg-1（临床等效剂量），健脾合剂高剂量组7.56 gkg-1（临床等效剂量3倍），空白对照组和模型对照组同法给予等体积生理盐水。各组于造模成功当天给药，每日给药1次，持续给药14天。2.3观察及检测指标2.3.1大鼠一般情况及体质量实验过程中，对各组大鼠全身毛发情况、精神状态、进食饮水、活动性、大便、体质量变化等情况进行观察
16、记录，并于给药第1天、给药第7天、给药第14天分别对大鼠体质量进行记录及比较。2.3.2大鼠粪便性状评分实验过程中，分别于给药第1天、给药第7天、给图1健脾合剂指纹图谱注：通过对照样品和文献查阅指认，其中3个共有峰分别为甘草苷（13号峰）、橙皮苷（16号峰）、甘草酸（19号峰）。表1健脾合剂组成中文名党参白术茯苓炙甘草陈皮山药拉丁文名Radix codonopsitis pilosulaeRhizoma atractylodis macrocephalaeSclerotium poriae cocosRadix glycyrrhizae preparataPercarpium citri re
17、ticulataeradix dioscoreae oppositae英文名TangshenSemen PharbitidisIndia BreadLiquorice RootDriedCommon Yam Rhizome剂量（g）555355产地甘肃浙江安徽内蒙古江苏河南表2Bristol分型积分标准状态便秘正常腹泻分型第一型第二型第三型第四型第五型第六型第七型积分值12345671104 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中
18、医药现代化中医药与肝肠疾病研究药第14天按Bristol分型积分标准（详见表2）对大鼠粪便性状进行评分。2.3.3大鼠内脏敏感性测定内脏敏感性检测在自制的大鼠固定观察室中进行，分别于给药前和治疗完成后对每只大鼠进行直肠扩张下腹壁回缩反射（Abdominal withdrawal reflex，AWR）评分检测14。具体方法：检测前大鼠禁食不禁水12 h，轻抚大鼠肛门，保证残余大便排尽，乙醚麻醉下将涂有石蜡油的导尿管插入肛门约6 cm，并将导尿管固定在大鼠尾根部。将大鼠放在自制透明固定观察室内，使其只能前后活动，不能转身。等待大鼠苏醒并适应环境后，缓慢向球囊内注气，采用AWR评分标准，观察大鼠腹
19、壁对肠腔球囊扩张刺激的反应，以腹部肌肉较强烈收缩并把腹部抬离地面时（AWR评分3分）的注气量（mL）作为大鼠内脏的疼痛阈值。每只大鼠进行3次球囊扩张，每次持续20 s，间隔5 min，取平均注气量。2.3.4大鼠肠道通透性检测治疗完成后对每只大鼠进行血清内毒素含量检测。采用显色基质鲎试剂检测大鼠血液中细菌内毒素含量，观察其肠道通透性变化。2.3.5大鼠结肠粘膜组织病理末次给药后，禁食不禁水24 h，麻醉处死大鼠，迅速剖腹，剖腹后分离大鼠结肠和直肠末端组织，留取结肠为8 cm，用生理盐水冲洗肠内容物，漂洗去血，放置4%甲醛溶液中固定，4冰箱过夜备用。将大鼠结肠粘膜冲洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、切
20、片及染色，镜下观察结肠组织黏膜水肿、炎症及病变深度情况。2.3.6Real-time PCR法检测大鼠结肠粘膜miR-219a-5p、miR-338-3p含量使用 SYBRGreen法进行 Real-time PCR 检测。取大鼠结肠粘膜组织，并设计引物序列，随后提取结肠组织总RNA消除总RNA中DNA反转录Real-time PCR扩增。数据分析均使用ABI Prism 7300 SDS Software软件。2.4统计学方法数据均由 SPSS 22.0 统计分析，以均值标准差（meanSD）的形式表示。采用t检验分析比较各组之间的差异。P0.05表示差异具有统计学意义。3 结果 3.1各组
21、IBS-D大鼠一般情况及体质量比较造模前，各组大鼠精神状态良好、活泼好动、皮毛顺整润泽、进食饮水正常、大便干稀适中。造模后，各模型组大鼠逐渐出现精神倦怠、易激怒、躲避、畏惧，行为迟缓、少动，皮毛枯乱无光泽，进食饮水减少，大便稀溏、甚则水样，体质量减轻，以上信息初步确认造模成功。给药后，健脾合剂低剂量组及高剂量组大鼠精神状态转佳，较为活泼好动，皮毛较为顺整润泽，进食饮水增多，大便成形。由表3可知，造模后各组大鼠体质量相当且明显低于空白组（P0.05）；相同给药天数下，健脾合剂低剂量组、高剂量组体质量均高于模型组（P0.05）；且健脾合剂高剂量组体质量较低剂量组有上升的趋势，但不具有统计学差异。3
22、.2各组IBS-D大鼠粪便Bristol评分比较由表4可知，造模后各组大鼠粪便Bristol评分明显升高（P0.05），IBS-D大鼠大便稀溏甚则水样；健脾合剂治疗后，低剂量组、高剂量组大鼠粪便Bristol评分较模型组均显著降低（P0.05），其大便成形，恢复正常。3.3各组IBS-D大鼠内脏敏感性比较由表5可知，造模后各组大鼠内脏疼痛阈值与空白组比较均有明显降低（P0.05），表明IBS-D大鼠内脏敏感性升高；健脾合剂治疗后，低剂量组、高剂量组大鼠内脏疼痛阈值较模型组均有所升高（P0.05），说明健脾合剂治疗后大鼠内脏敏感性降低。3.4各组IBS-D大鼠肠道通透性比较由表6可知，模型组大鼠
23、血清内毒素含量较空白表3各组IBS-D大鼠体质量比较（x s，n=8）组别空白对照组模型对照组健脾合剂低剂量组健脾合剂高剂量组剂量（gkg-1）-2.527.56时相点体质量（g）给药第1天362.502.83284.504.24a275.5017.68a281.634.24a给药第7天361.004.24288.000.71a310.5015.56ab316.388.49ab给药第14天365.131.41296.132.83a339.256.36b344.6312.73b注：与空白对照组比较，aP0.05；与模型对照组比较，bP0.05。1105 Modernization of Trad
24、itional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第三期 Vol.25 No.3 组升高（P0.05），表明IBS-D大鼠肠道通透性增加；健脾合剂治疗后，低剂量组、高剂量组大鼠内毒素含量较模型组均有所降低（P0.05），且接近于空白组水平，说明健脾合剂治疗后大鼠肠道通透性降低。3.5各组IBS-D大鼠结肠粘膜组织病理学观察各组大鼠结肠病理结果详见图2。空白对照组：结肠组织黏膜上皮完整，未见明显水肿，固有层腺体排列紧密，未见上皮细胞脱落变性及坏死。模型对照组：结肠组织黏膜上皮轻度
25、破损，局部可见水肿，周围可见少许炎性细胞弥散性浸润，淋巴组织增生。健脾合剂低剂量组：结肠组织黏膜上皮破损减轻，局部水肿改善，与模型组相比较，上述情况有所改善。健脾合剂高剂量组：结肠黏膜上皮完整，局部水肿不显，固有层腺体排列紧密，未见上皮细胞脱落变性及坏死，与模型组相比较，上述情况得到显著改善。3.6各组 IBS-D 大鼠结肠粘膜 miR-219a-5p、miR-338-3p相对表达比较对各组大鼠结肠黏膜进行 Real-time PCR 检测，miR-219a-5p、miR-338-3p 的熔解曲线均为单一峰，PCR扩增特异性良好。如表7、图3、图4所示，各组miR-219a-5p表达水平比较：
26、模型组大鼠结肠黏膜miR-219a-5p较空白组显著降低（P0.01）；健脾合剂治疗后，高剂量组大鼠miR-219a-5p较模型组显著升高（P0.01），且较低剂量组有所升高（P0.01），接近于空白组水平。各组miR-338-3p表达水平比较：模型组大鼠结肠黏膜miR-338-3p较空白组显著降低（P0.01）；健脾合剂治疗后，高剂表4各组IBS-D大鼠粪便Bristol评分比较（x s，n=8）组别空白对照组模型对照组健脾合剂低剂量组健脾合剂高剂量组剂量（gkg-1）-2.527.56Bristol评分（分）给药第1天3.750.716.880.35a6.880.35a6.750.46a给
27、药第7天3.630.526.750.46a5.250.71ab5.130.83ab给药第14天3.750.466.750.71a4.500.53ab4.250.71b注：与空白对照组比较，aP0.05；与模型对照组比较，bP0.05。表6各组IBS-D大鼠血清内毒素含量比较（x s，n=8）组别空白对照组模型对照组健脾合剂低剂量组健脾合剂高剂量组剂量（gkg-1）-2.527.56内毒素（EUmL-1）1.270.001.370.01a1.280.01b1.280.00b注：与空白对照组比较，aP0.05；与模型对照组比较，bP0.05。表5各组IBS-D大鼠内脏疼痛阈值比较（x s，n=8）
28、组别空白对照组模型对照组健脾合剂低剂量组健脾合剂高剂量组剂量（gkg-1）-2.527.56疼痛阈值（mL）给药第1天8.290.556.580.58a6.330.69a6.330.87a给药第14天8.210.406.670.44a7.750.46b7.790.75b注：与空白对照组比较，aP0.05；与模型对照组比较，bP0.05。图2各组IBS-D大鼠结肠黏膜组织病理学观察（HE染色，100，200）注：A：空白对照组；B：模型对照组；C：健脾合剂低剂量组；D：健脾合剂高剂量组。1106 Modernization of Traditional Chinese Medicine and
29、Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中医药与肝肠疾病研究量组大鼠miR-338-3p较模型组有所升高（P0.01）。4 讨论 IBS-D属于中医“泄泻”“腹痛”“飧泄”“鹜溏”等范畴，结合吴门医派学术思想，泄泻的基本病机为脾虚湿盛，其病位在肠，主病之脏属脾。我院临床长期运用“健脾法”，使用院内制剂“健脾合剂”等健脾中药对IBS-D患者进行治疗，显著改善患者腹痛、腹胀、腹泻等主要症状，深受患者欢迎。健脾合剂为四君子汤加味，是全国著名脾胃病专家、吴门医派大家、江苏省名老中医黄一峰先生的经验方，已在院内应用近30年，药物组
30、成为：党参、白术、茯苓、甘草、陈皮、山药，整方具有健脾养胃、助运化滞的作用。现代药理学研究表明，四君子汤不仅能够促进IBS-D小鼠肠道中益生菌双歧杆菌、乳酸杆菌菌数量的增加，维持肠道菌群的动态平衡；还能够显著降低促炎因子的分泌，保护肠黏膜的免疫屏障功能15。山药可促进十二指肠和空肠生长发育，其水提物不仅能够促进盲肠菌群物种丰度，还可以降低肠黏膜通透性，保护肠黏膜屏障功能16。陈皮则能够缓解胃肠平滑肌痉挛，抑制胃肠平滑肌紧张性，为改善IBS-D患者的症状提供帮助17。课题组前期研究提示，健脾合剂在调节菌群、抗炎和改善肠粘膜屏障方面有作用，且能明显改善患者及小鼠的主要症状，疗效显著。西医方面，既往
31、研究认为，IBS-D的发病因素以遗传、胃肠道功能异常、内脏高敏性、肠道炎症与免疫功能障碍、脑-肠-菌轴反馈异常为主2。近年来，另有大量证据表明，miRNAs的改变可能是IBS发病机制中的重要促发因素。MiRNAs是一类长18-25个核苷酸高度保守的内源性非编码单链RNA小分子，其参与了多种功能性胃肠病的生理和病理生理机制，并在肠道免疫和炎性疾病中得到广泛研究9-10。目前，国内关于miRNAs与IBS的研究较少，国外报道则普遍认为，一些miRNAs在IBS的内脏高敏感性、屏肠道障功能障碍方面起关键作用，是该疾病的重要病理生理机制18-19。但现阶段关于肠易激综合征的miRNA研究具有高度异质性
32、，学者们只是分别对单独不同的miRNA进行实验，并无相对统一的研究结论；且对miRNA作用于IBS的病理过程及具体途径研究较少。直至Mahurkar等11于 2021年2月在Gastroenterology上发表了一篇报道。该团队对IBS患者与健康人结肠黏膜的247种miRNAs表7各组IBS-D大鼠结肠黏膜miRNA-219a-5p、miRNA-338-3p相对表达比较（x s）组别空白对照组模型对照组健脾合剂低剂量组健脾合剂高剂量组剂量（gkg-1）-2.527.56miRNA-219a-5p1.000.240.500.07aa0.610.07a0.930.09bbcmiRNA-338-3
33、p1.000.120.510.07aa0.630.14a0.840.06abb注：与空白对照组比较，aP0.05，aaP0.01；与模型对照组比较，bP0.05，bbP0.01；与健脾合剂低剂量组比较，cP0.05。图3各组IBS-D大鼠结肠黏膜miRNA-219a-5p相对表达比较图4各组IBS-D大鼠结肠黏膜miRNA-338-3p相对表达比较1107 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第三期 Vol.25 No.3
34、 进行了检测，发现IBS患者结肠黏膜的miRNA-219a-5p、miRNA-338-3p水平降低。通过进一步研究表明，miRNA-219a-5p的下降导致了肠道通透性的增加，从而破坏肠道屏障功能，促使 IBS 的发生。更提出miRNA-338-3p的减少在内脏高敏感中发挥作用，导致IBS患者腹痛、腹胀的表现。另有研究指出，miRNAs与IL-6的联系也相当密切，两者之间互相影响，从而在机体的炎症反应中发挥作用。Shi等20指出：炎症状态的肠黏膜中，IL-6的增加能够降低miR-219a-5p的表达，从而促进炎症的进一步发展；而降低IL-6的水平能够增加miR-219a-5p的表达，从而阻止炎
35、症的发展。本研究通过急-慢应激法联合番泻叶灌胃法制备IBS-D大鼠模型，发现各模型组大鼠精神倦怠，行为迟缓，皮毛枯乱，进食减少，大便稀溏甚则水样，体质量下降，初步表明IBS-D大鼠造模成功。健脾合剂治疗后，低剂量组及高剂量组大鼠精神良好，活泼好动，皮毛顺整润泽，进食增多，大便成形，其粪便Bristol评分较IBS-D大鼠显著降低，且体质量较IBS-D大鼠有所增加。内脏敏感性评估结果显示，健脾合剂干预后，低剂量组及高剂量组大鼠内脏疼痛阈值有所升高，提示健脾合剂具有降低 IBS-D 大鼠内脏敏感性的作用。血液中的内毒素含量是评价肠道屏障功能的指标之一。本研究结果表明，给予健脾合剂干预后，低剂量组及
36、高剂量组大鼠的内毒素含量较前下降，提示健脾合剂可降低IBS-D大鼠肠道通透性，改善IBS-D大鼠肠道屏障功能。大鼠结肠粘膜病理结果表明，IBS-D大鼠结肠组织黏膜上皮轻度破损，局部可见水肿。健脾合剂治疗后，低剂量组及高剂量组大鼠结肠黏膜上述情况得到有效改善，提示健脾合剂具有修复IBS-D大鼠肠粘膜的作用。Real-time PCR 法检测大鼠结肠粘膜结果显示，IBS-D 大鼠 miR-219a-5p、miR-338-3p 水平显著降低，健脾合剂治疗后，高剂量组大鼠 miR-219a-5p、miR-338-3p含量有所升高，提示健脾合剂能够提高IBS-D大鼠miR-219a-5p、miR-338
37、-3p表达水平。本实验结果表明，IBS-D大鼠内脏敏感性升高，肠道通透性增加，肠道屏障功能受损，结肠黏膜 miR-219a-5p、miR-338-3p的表达水平降低。健脾合剂干预后，其内脏敏感性降低，肠道通透性降低，肠道屏障功能改善，结肠黏膜得以修复，结肠黏膜 miR-219a-5p、miR-338-3p的表达水平有所升高。结果提示，IBS-D肠道通透性升高的病理机制可能与miR-219a-5p的调控有关，内脏高敏感性的病理机制可能与 miR-338-3p的调控有关，健脾合剂可能通过对miR-219a-5p的调控减轻IBS-D大鼠肠道高通透性的病理状态，通过对 miR-338-3p的调控减轻内
38、脏高敏感性的病理状态，改善IBS-D症状。结合既往研究结论及本次实验结果，推测健脾合剂能够维持肠道菌群的动态平衡，减少 IL-6 含量，或能通过增加miRNA-219a-5p、miRNA-338-3p水平，降低肠道通透性及内脏敏感性，从而发挥疗效。本实验仅是对miR-219a-5p、miR-338-3p 与 IBS-D 关 系 的 初 步 研 究，miRNAs 的生物学功能复杂，健脾合剂对 miR-219a-5p、miR-338-3p 及靶基因的调控作用及其靶基因与IBS-D病理机制的关系还需要进一步探讨。参考文献 21Canavan C,West J,Card T.The epidemiol
39、ogy of irritable bowel syndrome.Clinical Epidemiology,2014,6:71-80.2Tan J J,Han S T.Advances in the etiology of irritable bowel syndrome.World J Integr Tradit Western Med,2011,6(5):443-444.3汪安江,陈旻湖.肠易激综合征药物治疗的循证医学评价.胃肠病学和肝病学杂志,2009,18(5):388-391.4Lian Q H,Ding H Y,Zhu H P,et al.Study of Jianpi mixtu
40、re on intestinal microbiota of diarrhea irritable bowel syndrome mice.Evid Based Complement Alternat Med,2020,2020:5241308.5丁姮月.基于高通量测序技术的脾虚型IBS-D肠道微生物变化的实验与临床研究.南京:南京中医药大学硕士学位论文,2020.6丁姮月,朱惠萍,梁国强,等.基于高通量测序技术的脾虚腹泻型肠易激综合征小鼠与健康小鼠肠道菌群的差异研究.中国中医基础医学杂志,2021,27(2):260-266.7连秋华.健脾合剂对腹泻型肠易激综合征脾虚证肠道菌群的干预研究.南
41、京:南京中医药大学硕士学位论文,2020.8张川,孙宏文,朱惠萍.健脾合剂对腹泻型肠易激综合征模型小鼠IgA、IL-6、IL-6mRNA 表达影响的实验研究.医药卫生,2020,5:97-98.9Wouters M M.Novel insight in diarrhoea-predominant IBS:MiRNAs modulate barrier function.Gut,2017,66(9):1537-1538.10 Hou Q K,Huang Y Q,Zhang C R,et al.MicroRNA-200a targets cannabinoid receptor 1 and ser
42、otonin transporter to increase visceral hyperalgesia in diarrhea-predominant irritable bowel syndrome rats.J 1108 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中医药与肝肠疾病研究Neurogastroenterol Motil,2018,24(4):656-668.11 Mahurkar J S,Rankin C
43、R,Videlock E J,et al.The colonic mucosal microRNAs,microRNA-219a-5p,and microRNA-338-3p are downregulated in irritable bowel syndrome and are associated with barrier function and MAPK signaling.Gastroenterology,2021,160(7):2409-2422.e19.12 Zou N,Lv H,Li J,et al.Changes in brain G proteins and coloni
44、c sympathetic neural signaling in chronic-acute combined stress rat model of irritable bowel syndrome(IBS).Transl Res,2008,152(6):283-289.13 Zhu J J,Liu S,Guo Y,et al.A new model of diarrhea with spleen-kidney Yang deficiency syndrome.Evid Based Complement Alternat Med,2018,2018:4280343.14 Kaelberer
45、 M M,Buchanan K L,Klein M E,et al.A gut-brain neural circuit for nutrient sensory transduction.Science,2018,361(6408):eaat5236.15 闫瑾,王冬梅,刘辰昊,等.四君子汤对于小鼠肠道菌群作用的Meta分析.中医学,2020,(6):494-505.16 梁小瑞.十味补益类、清热类中药对肉鸡肠黏膜屏障功能的影响.新疆:石河子大学硕士学位论文,2020.17 王昌亚.对陈皮药理作用的探讨.临床医药文献电子杂志,2020,7(15):135.18 Zhu H,Xiao X,Ch
46、ai YA,et al.MiRNA-29a modulates visceral hyperalgesia in irritable bowel syndrome by targeting HTR7.Biochem Bioph Res Co,2019,511(3):671-678.19 Hou Q K,Huang Y Q,Zhu S L,et al.MiR-144 increases intestinal permeability in IBS-D rats by targeting OCLN and ZO1.Cell Physiol Biochem,2017,44(6):2256-2268.
47、20 Shi Y,Dai S,Qiu C,et al.MicroRNA-219a-5p suppresses intestinal inflammation through inhibiting Th1/Th17-mediated immune responses in inflammatory bowel disease.Mucosal Immunol,2020,13(2):303-312.Study on the Mechanism of Jianpi Mixture Interfering with IBS-D Rats by Regulating miRNA-219a-5p and m
48、iRNA-338-3pDing Hengyue1，Wang Meng1,2，Yang Xin2,3，Liang Guoqiang1，Wu Tingting1,2，Zhang Peipei1,2，Sun Hongwen1(1.Suzhou TCM Hospital Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine,Suzhou 215009,China；2.Graduate School,Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210023,China；3.The Affiliated
49、Suzhou Science&Technology Town Hospital of Nanjing Medical University,Suzhou 215153,China)Abstract:ObjectiveTo explore the mechanism of Jianpi Mixture in interfering with diarrhea-predominant irritable bowel syndrome(IBS-D)model rats based on miRNA-219a-5p and miRNA-338-3p.MethodsThe IBS-D rat model
50、 was prepared by the acute-slow stress method combined with senna gavage method.After the rats were divided into groups,they were given the intervention of Jianpi Mixture.During the experiment and after the treatment,the general condition,body weight and fecal traits of the rats were recorded.In thi
