1、东南大学学报(医学版)()():负担与应对方式的关系研究.上海护理():.韦荣泉廖丹邓腾等.脑肿瘤患者主要照顾者照顾负担现状及影响因素研究.护理管理杂志():.():.李艳黄永霞赵爱平等.上海市社区失能老人家庭主要 照顾者焦虑与抑郁情绪现况调查及影响因素分析.护理研究():.苌凤水吕军解海霞等.社区脊髓损伤患者照顾者的照顾负担及影响因素分析.上海护理():.:.():.收稿日期 修回日期 基金项目 江苏省社会发展项目()作者简介张诗晗()女江苏盐城人在读博士研究生:.田华()女甘肃兰州人主任技师医学硕士:.并列第一作者通信作者 金辉:.朱立国:.引文格式 张诗晗田华姜娜等.基于微量中和试验的社
2、区健康人群新型冠状病毒中和抗体高通量检测方法评价.东南大学学报(医学版)():.论著 基于微量中和试验的社区健康人群新型冠状病毒中和抗体高通量检测方法评价张诗晗田华姜娜王笑辰黄昊頔李楚楚孔筱筱董晨周璐彭杰夫郭喜玲金辉朱立国(.东南大学公共卫生学院流行病与卫生统计学系 环境医学工程教育部重点实验室江苏 南京.江苏省疾病预防控制中心 急性传染病防制所江苏 南京.建邺区疾病预防控制中心 免疫计划科江苏 南京)摘要 目的:以微量中和试验为金标准评价胶体金法和酶联免疫吸附法这两种高通量检测方法的检测能力 方法:以江苏省南京市某社区招募的 名健康成年人为研究对象采集血样开展中和抗体水平分析用微量中和试验、
3、胶体金法和酶联免疫吸附法分别对血样进行测试评价这两种高通量中和抗体检测方法的灵敏度、特异度及与金标准的相关系数等 结果:当金标准的判定界值取为 时(为阴性)胶体金法的灵敏度为.特异度为.正确指数为.与金标准之间的 值为.酶联免疫吸附法的灵敏度为.特异度为.正确指数为.值为.这两种方法相对于微量中和试验的相关系数为.结论:建立的新型冠状病毒中和抗体高通量检测方法具有科学性和可行性关键词 微量中和试验 社区健康人群 中和抗体 高通量中图分类号.文献标志码 文章编号():./.(.):.:.:.:.由新型冠状病毒()感染导致的新型冠状病毒肺炎()疫情已全球大流行截至 年 月 日 已经造成了全球超 亿
4、人确诊累计死亡超 万人 属于 属冠状病毒为线性单股正链的 病毒有包膜颗粒呈圆形或椭圆形常为多形性 病毒颗粒刺突蛋白()是高度糖基化的蛋白介导病毒与宿主表面 受体结合与膜融合被认为是最相关的引起关键抗体反应的抗原 中和抗体()正是这类关键抗体它是针对病毒某些表面蛋白质、抵御病毒入侵机体的一类免疫球蛋白 中和抗体结合域主要在 蛋白通过封闭与易感细胞受体结合的病毒抗原表位或改变病毒表面构型阻止病毒吸附、侵入细胞 中和抗体常是评价机体对病原体免疫的关键因子用血清学试验评估新型冠状病毒感染后体液免疫反应对于进一步控制 大流行至关重要血清学检测是一种易于实施且成本效益高的方法可以快速识别接触病毒的个人对疫
5、苗诱导产生中和抗体的检测也同样适用 中和活性常采用感染抑制试验来评价其中利用活病毒进行噬斑减少中和试验()和通过观察细胞病变()计算抑制组织细胞半数感染量的血清稀释度的微量中和试验是常用方法 其中微量中和试验()是评估中和抗体水平的金标准但该方法需要 周的实验周期需要在生物安全 级实验室()开展需要专业人员操作 另外由于不同实验室使用的病毒株、培养条件和结果判读标准存在差异活病毒检测结果常难以直接比较 因此寻找一些高通量中和抗体检测方法显得尤为必要目前已开发出多种基于不同方法学的高通量检测方法包括假病毒中和抗体试验、酶联免疫吸附法、化学发光免疫法、荧光免疫层析法和胶体金法等 酶联东南大学学报(
6、医学版)年 月()免疫吸附法是基于单抗原表位或多抗原表位采用竞争抑制原理进行中和抗体检测的一种方法具有检测速度快、自动化程度高、特异性强和易于在基层疾控机构推广应用的特点胶体金试纸条简便快捷进行快速定性分析 这些高通量检测技术应该开发用于新冠病毒中和抗体检测在全球 疫情依然严峻和我国 疫情防控常态化的背景下以基于活病毒和 开展的微量中和试验为金标准评估这些中和抗体高通量检测方法相对于金标准的灵敏度、特异度、符合率等指标是这些方法能够得以应用的前提条件 本研究以从江苏省南京市某社区招募的 名健康成年人为研究对象利用胶体金法对不同类型的血样(全血、血浆、血清)中和抗体检测结果进行通适性验证进一步比
7、对胶体金法和酶联免疫吸附法的检测结果与金标准之间的差异从而评价这两种高通量检测方法用于常规中和抗体检测的可行性 对象与方法.研究设计本研究是以基于活病毒和 开展的微量中和试验为金标准比对胶体金法和酶联免疫吸附法的检测结果与金标准之间的差异是一项筛检试验.研究对象于 年 月 日至 月 日期间以江苏省南京市某社区招募的 名健康成年人为研究对象采集年龄 岁的新冠疫苗接种者和新冠疫苗未接种者血液标本并转运至指定实验室其中新冠疫苗接种者均为半年内完成安徽智飞龙科马疫苗规定程序的人群每人采集两管血每管不少于 共采集 人份新冠疫苗未接种者为未感染新型冠状病毒且未注射新冠疫苗的人群每人采集两管血每管不少于 共
8、采集 人份.实验方法.微量中和试验 采用固定病毒稀释血清的方法进行微量中和试验 将血清以 倍倍比稀释至 每个稀释度做 个复孔将 分离的 病 毒 株 原 始 浓 度 (为半数组织培养感染剂量)用 维持液稀释成 (以 的 培养基稀释)每孔加入 混匀后放入含 的 培养箱里中和 以每孔 混合液加入到已长成单层 细胞的 孔板内与此同时设置血清对照组、病毒对照组和正常细胞对照组 再加入细胞悬液后继续置于 的 培养箱中培养 每 在倒置显微镜下观察 并记录不同滴度值的分布情况 为 为 为 为 正常细胞形态为 病毒对照出现 时结束试验 血清中和终点为能保护 细胞不产生病变的血清最高稀释度即为中和终点 按照 方法
9、计算 血清中和终点 本实验在 实验室开展.酶联免疫吸附法用重组人 受体蛋白()包被微孔板辣根过氧化物酶()标记 蛋白()制备酶结合物 将 自然感染或者接种新冠疫苗后机体血清样本与 在酶标板外进行预孵育之后转入 包被微孔板内 蛋白将与血清样本中的中和抗体同时竞争结合 当机体中未产生中和抗体时 直接与 相结合如果机体产生中和抗体时中和抗体就会与 结合未结合中和抗体的 就会与固定在酶标板的 结合经洗涤后加入显色工作液底物在酶的作用下生成有色产物终止后在 波长处读取吸光度值吸光度与样本中中和抗体的有效活力成反比 单次检测中阴性对照品及样本的 用于算待测样本血清中的抗体抑制率阳性对照品 用于检测有效性判
10、断 待测样本中和抗体抑制率的计算方法如下:抑制率 (样品/阴性对照 平均值)结果解释:抑制率 为阳性抑制率 为阴性 该试剂由江苏美克医学技术有限公司提供.胶体金法抗原选用高特异性的新型冠状病毒 蛋白的受体结合结构域()能对人体产生的总中和抗体进行有效检测 该检测方法不需要任何仪器 当样本中含有 中和抗体且浓度最低检测限时中和抗体与抗原标志物结合被检测区()二抗捕获形成红色反应线此时结果为阳性反之则不显色结果判为阴性 该方法简便快捷可以进行快速定性分析 该试剂由江苏美克医学技术有限公司提供.统计学处理应用 软件对流行病学资料和实验室数据进行录入和管理资料分析采用 .软件 分析方法包括计算灵敏度、
11、特异度、阳性预测值、阴性预测值、符合率、正确指数及 相关系数 .表示差异有统计学意义 本研究中金标准的最佳截断张诗晗等.基于微量中和试验的社区健康人群新型冠状病毒中和抗体高通量检测方法评价值的选取为探索性的 结 果.研究对象的人口学基本特征本研究招募的 名健康成年人中男性有 人占比女性有 人占比 性别比为(女 男.)研究对象年龄分布范围较广从 岁到 岁不等多集中在 岁以下()而 岁及以上的对象仅占比 按是否接种完 针疫苗将人群分为两大类其中完成疫苗规定程序的有 人占比未接种疫苗的健康成年人有 人占比.针对微量中和试验的不同临界值对两种高通量检测方法的评价 如表 所示当金标准取不同滴度时统计出胶
12、体金法和酶联免疫吸附法这两种高通量检测方法的阳性检出率 通过比较胶体金法对全血、血浆和血清的检测结果经计算发现两两之间的一致率均为 表明针对不同类型的血液样本胶体金检测方法的一致性都很好根据表 所示的阳性检出率我们发现当 滴度达到 时两种高通量检测方法的阳性检出率均为 因此本研究中我们选取 和 这两个判定界值进而对两种高通量检测方法的结果进行评价 如表 所示当金标准的判定界值取为 时(为阴性)胶体金法的灵敏度为.特异度为.阳性预测值为.阴性预测值为.正确指数为.与金标准之间的 值为.同理可得酶联免疫吸附法的评价结果当金标准的判定界值取为 时(为阴性)胶体金法的灵敏度为.特异度为.阳性预测值为.
13、阴性预测值为.正确指数为.与金标准之间的 值为.同理可得酶联免疫吸附法的评价结果表 金标准不同滴度时两种高通量检测方法的检出率 阳性人数(.)(.)(.)(.)(.)(.)(.)(.)(.)(.)(.)()()()()()()()()()()()(.)()()()()()()()()()()()()注:、和 分别代表胶体金法全血、胶体金法血浆、胶体金法血清以及酶联免疫吸附法血清括号中为所占百分比 为了评价两种高通量检测方法对不同特征人群的检测结果有无差异性我们进行了分层分析结果见表 和表 将研究对象按照年龄和性别分层当金标准取 判定界值时男性对象中胶体金法的检测灵敏度为.特异度为.酶联免疫吸附
14、法的检测灵敏度为.特异度为.女性对象中胶体金法的检测灵敏度为.特异度为 酶联免疫吸附法的检测灵敏度和特异度均为.岁人群中用胶体金法检测的灵敏度为.特异度为.用酶联免疫吸附法检测的灵敏度为.特异度为.岁人群中两种高通量检测方法的灵敏度均为.特异度均为.同理可以得到金标准取 判定界值时两种高通量检测方法的分层评价结果东南大学学报(医学版)年 月()表 金标准不同判定界值下两种高通量检测方法的评价结果 金标准不同判定界值高通量方法灵敏度/特异度/阳性预测值/阴性预测值/正确指数/约登指数 值 胶体金法.酶联免疫吸附法.胶体金法.酶联免疫吸附法.表 金标准取 判定界值时两种高通量检测方法的分层评价结果
15、 人群特征金标准取 时阳性人数/阴性人数胶体金法酶联免疫吸附法灵敏度/特异度/假阳性率/假阴性率/灵敏度/特异度/假阳性率/假阴性率/全部对象/.性别 男/.女/.年龄 岁/.岁/.表 金标准取 判定界值时两种高通量检测方法的分层评价结果 人群特征金标准取 时阳性人数/阴性人数胶体金法酶联免疫吸附法灵敏度/特异度/假阳性率/假阴性率/灵敏度/特异度/假阳性率/假阴性率/全部对象/.性别 男/.女/.年龄 岁/.岁/.张诗晗等.基于微量中和试验的社区健康人群新型冠状病毒中和抗体高通量检测方法评价.高通量检测方法相对于微量中和试验的相关系数 微量中和试验取 判定界值和 判定界值时两种高通量检测方法
16、与金标准间的相关系数见表、以判定界值 为例针对全部研究对象胶体金法和酶联免疫吸附法与金标准间的相关系数均为.对检测对象进行亚组分析胶体金法对男性对象的检测结果与金标准间的相关系数为.对女性为.酶联免疫吸附法对男性对象的检测结果与金标准间的相关系数为.对女性为.按年龄分层 岁人群中应用胶体金法的相关系数为.酶联免疫吸附法的相关系数为.岁人群中两种高通量检测方法与金标准间的相关系数均为.同理可得金标准判定界值取 时的各类相关系数表 金标准取 判定界值时的相关系数 微量中和试验()胶体金法酶联免疫吸附法相关系数 值相关系数 值全部对象.性别 男.女.年龄 .表 金标准取 判定界值时的相关系数 微量中
17、和试验()胶体金法酶联免疫吸附法相关系数 值相关系数 值全部对象.性别 男.女.年龄 .讨 论防治 以早发现、早报告、早隔离、早诊断、早治疗的“五早”为最有效方法目前实验室检测以核酸检测技术为主检测结果会受到病程、标本采集、检测过程、检测试剂等因素的影响为提高检测准确性应规范采集标本采集后尽快送检 而血清学检测是一种辅助性的诊断方法可以弥补核酸检测方法的不足 本研究以江苏省南京市某社区招募的 名健康成年人(未接种疫苗 接种疫苗.)为研究对象评价胶体金法和酶联免疫吸附法这两种高通量检测方法相较于微量中和试验(金标准)对血清中和抗体的检测真实性为能否将这两种方法投入临床应用东南大学学报(医学版)年
18、 月()提供科学依据 从研究结果来看无论金标准选取 还是 的判定界值两种高通量检测方法的灵敏度、特异度、阳性预测值及阴性预测值都在 以上 值也都大于.此结果要高于苏娟等用胶体金法做出的结果 而对于酶联免疫吸附法这一高通量检测方法本研究团队在此前针对新型冠状病毒感染者血清也做了类似研究比较酶联免疫吸附法与金标准间的一致性相关系数在.以上灵敏度达 此外为了探究这两种高通量检测方法对不同特征人群的检测效果是否不同我们进行了亚组分析发现用酶联免疫吸附法对男性血清中和抗体的检测灵敏度要略低于胶体金法的结果对于 岁人群两种方法的检测灵敏度都较低为.针对此结果我们分析由于老年人接种新冠疫苗的人数较少(本研究
19、对象中仅有/人)因此阳性检出率存在偶然性不如大样本得出的代表性强 从两种高通量检测方法与金标准间的相关系数来看相关性都较高综上所述本试验结果显示从检出率、各种评价指标上看两种高通量检测方法具有可行性 本研究也存在一些局限性:首先这两种高通量检测方法均得出的是定性分析结果无法用于保护力的评判其次尚未开展交叉反应的实验针对有其他临床表现和感染的对象是否可以鉴别尚不清楚 另外由于招募的是南京市某社区健康人群样本量和代表性不足试验结果的外推尚不具备强有力的说服性 目前仅接种灭活苗而未感染的人群和既未接种疫苗又未感染的对象在国内较为稀缺因此这类样本较为珍贵后续将在有条件的情况下扩大样本量验证上述高通量检
20、测方法的有效性参考文献 .():.:/.:./.刘晓瑜魏永伟.蛋白:研究进展与挑战.病毒学报():.:.():.:.():.():.:.():.():.:.():.():.():.杜剑晖潘勇兵杨晓明.新型冠状病毒中和抗体的研发策略及研究进展.中国生物制品学杂志():.苏娟梁丹黎薇.基于微量中和试验的新冠肺炎临床确诊病例血清样本的抗体检测方法评价.中华实验和临床病毒学杂志():.关于印发新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第九版)的通知/.:./.孔筱筱张诗晗李志锋等.基于微量中和试验的新冠感染者血清样本中和抗体高通量检测方法评价.中华实验和临床病毒学杂志():.张诗晗等.基于微量中和试验的社区健康人群新型冠状病毒中和抗体高通量检测方法评价
