1、 ICs 11,o 2oC50中 华 人 民 共 和 国 卫 生 行 业 标 准Ws/T360 2011流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群Gu i d e n e s f o r p e r i p h e r a I Iy m p h o c y t e s u b s e t s b y n o w c y t。m e t r y指 南2011-12-14 发布中华人民共和国卫生部 发 布2012-o 6-o 1 实 施WS/T3602011曰本标准按照GB/T1.109给出的规则起草。本标准由卫生部临床检验标准专业委员会提出。本标准主要起草单位:中国医学科学院北京协和医院。本标准主要起草人
2、:崔巍、黄春梅、王斐、杨卓、陈倩。亠刖VVs/T 360-2011流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南l 范 围本标准规定 了流式 细 胞 术 检 测 外 周 血淋 巴细胞 亚 群(T细胞、B细胞、NK细胞、CDl T细胞 和CD8+T细胞)的技 术要点,包括标 本 采集 和运输、免疫 荧光 染 色技 术、流 式 细胞 仪检 测 和分 析、结果 报告和审核等方 面。2 术语和定 义下列术语 和定 义适用 于本 文件。2.1分化抗原 c Iu s t e r o f d i f f e r e n t i a t i o n,CD不 同谱 系细胞 在分化、成 熟、活化过程 中,出现或消 失的细胞
3、 表 面标 志。细胞 表 面标 志通 常用单 克隆抗体来识 别。每 个抗体 都有指定 的CD编号,能被特定抗体识 别的特定抗原通 常 具有 相 同的编号,例如,被“CD1抗体”识 别的抗 原称为“t l Dl 抗原”。2.2目 亍 向散身 寸 光 f o r w a r d a n g【e Ii g h t s c a t t e r FALs、Fs C、Fs光学检测器在人射光 的正前方所收集 的低角度光信号,勹细胞 或颗粒 的大小和体积有关。2.3侧 向散射光 s i d e a t t e r,s s C光学检测器在 人射光 的直 角处所 收集 的细胞散射 的光信 号,与细胞或颗 粒 的
4、内部 和 表 面结构 复杂程度有关,如细胞质 颗粒性、膜不 规则性 及核形等。2,4亥 乏 爿 强店 芰 f l u o r e s c e n c e i n t e n s y结合到细胞或颗粒上 的荧 光 素 的量。荧 光信 号 的通道 数越 大提 示 荧 光 强 度越 强。在恰 当的条件下,荧光强度 与一个 细胞 和特定荧光素相结合 的位点数相关。2.5自发荧光 a u t o f Iu o r e s c e n c e未染 色细胞 白身 发出的荧光。通 常 由嘧啶和黄素核 苷酸所产 生,白发荧 光 的强度 取决 于激发光 的波长,且随所分析细胞 的类 型和(或)细胞活化状态而改变。通
5、过 特殊 的标 本 处理 方 法 可 以降低 白发荧光的强度(如丿|j 结晶紫孵育)。2.6颜色补偿 c o Io r c o m p e n s a t i o n由于一种荧 光素发射 的荧 光叠加 到其他荧光素发射 的波长范 围 内而 造成 荧 光佶 号重 叠,通过 在其他荧光信 弓巾扣 除 已测 定荧 光信 号的一部分 而纠正颜色重叠造成 的计数错误。扣 除的荧光量是用恰 当的单 染对照来确 定 的.被校正 的信 号反映 了单荧光信 号的发射情况。2.7以 芝 门 g a t e在流式细胞仪 显示 的象限 图上基于一组参数(女口 荧 光对s SC.s C/s SC等)来确定 的所要 分析
6、 的 目lWs/T360-2011的细胞群.又寸 限定 区 内的 目的细胞群通过其 他参 数(如荧光参数)进 一步分析其表达情况。2.8双平 台方法 d u a I-p Ia t f o r m m e t h o d i DP用于流式细胞术测 定细胞绝对计数 的一 种方法,结果 来源于 流式细 胞仪 和第二种仪 器 的检 测。第二种仪 器通 常是血 细胞 分析仪。流式 细胞 仪 用 于获取 出现 于较 多 量靶 细胞群 中的 目的细 胞 亚 群 的 比例,靶细胞群通常 是淋 巴细胞群或 白细胞群。用第工种仪器分析 同一标 本靶细 胞群 的绝对 浓 度 这 两个测定结 果相乘 所得 即为 目的
7、细胞群 的绝对 浓度。该 方法 的缺点是包含两种体 系的系统误差。2,9单平 台方法 s i n g l e-p l a t f o r m m e t h o d,s P用 于流式细胞术测 定细胞绝对浓度 的一种方法,所有 结果均来 自流式细胞 仪一台仪器 的测定。浓度 的测定可 以直接通过测 定体积 的方法或 问接 的通 过加入 已知浓度 的荧光微球 来计算。单平 台方法免去 了第二台仪器 的所产 生 的系统误差。3 试剂3,1 荧光素标记 的单克 隆抗体采用荧光素 直接标 记 的单 克隆抗体(单抗),称直标抗 体。选择 直标抗体 是淋 巴细胞 亚群分 析 的关键步骤,要考 虑所选抗体 对
8、细胞 的反应性。3。1.1 单抗CD45、CD3、CD4、CD8、CD19、CD16、CD56。3.1.2 单抗对 细胞 的反应性CD45表达 于所有 白细胞;CD3表达于T淋巴细胞;CD4表达 于T辅助/诱导淋 巴细胞(CD4+T细胞)和单核细胞;CD8表达 于细胞毒T细胞(CD8T)和NK细胞;CD19表达于B淋巴细胞;CD16表达于NK细胞、单 核 巨噬细胞、粒细胞和树突状细胞等;CD56表达 于NK细胞和细胞毒T细胞。3.1.3 单抗对 淋 巴细胞 亚群 的鉴定CD4、CD8、CD16和 CD56单抗均不能特异性标记淋 巴细胞某一亚群。采用CD45和(或)CD3作为设 门抗体,同时兼
9、做 质 控 试 剂。CD3_T细胞 标 记 为CD3_,CD4T细胞标 记 为CD3 CD4,CD8T细胞标记 为CD3CD8+,B细胞标 记 为CD3CD19_,NK细胞标记 为CD3CD56+或 CD3CD(16+56),。3,1,4 直标抗体 常用荧光染料异硫氰 酸荧 光 素(FITC)、藻 红 蛋 白(PE/RD1)、藻 红 蛋 白偶 联 物(PECY5)、多 甲藻 叶 绿 素 蛋 白(Pe P)、藻红 蛋 白-德州红偶联物(ECD)和别 藻青 蛋 白(APC)。除别 藻青 蛋 白(APC)外,其他荧 光 染料均采用488n m 的激 发光源激发,最大发射波 长分别 为525n m、5
10、75n m、670n m、675n m 和613n m。别藻青蛋 白(APC)的激 发 光源为630n m,最大发射波长 为660n m。3.2 溶血素使用与仪器 相 匹配 的溶血素(内含 固定液),并严格按 照使用 说 明和注意事 项进行操作。如果使用没有固定作用 的溶血剂(如氯化铵 和低渗缓 冲液等),染色后标本需要保存在4,并在1h 内完成 上 机2Ws/T 360-2011检测。3.3 定量微球用于淋 巴细胞亚群绝对计数。常用 的商 品化 荧 光微球包括Fl o w-C。u n t TM(Be c k m a n Co u 1t e r)、FCSC Co u n t St a n d
11、a r d t M(Fl o w C v t m e t r y St a n d a r d s Co r p o r a t o n)和Tr u Co u n t TM(Be c t o n Ek k n s 等。4 标本采集和处理4.1 生物安全血液和体液标本中可能存在致病性甚至致死性 的活体病原微生物,所有标本都应 当作潜在传染源来处理。4.1.1 标本采集避免被针头刺伤,针头丢弃人利器盒中,严禁复帽、弯曲、折断针头或者从注射器上取下针头。4.1,2 安全着装所有接触血液标本的人员都应戴手套、穿实验室工作服。当标本处理过程中有飞溅 的可能性,应带好口罩和防护眼罩,避免眼、口、鼻等部位接
12、触标本。在所有工作结束后和离开实验室前,应脱掉手套并洗手。4.1.3 生物安全柜(Bs C)所有 的操作都应该在生物安全柜中进行(I类或 类BSC);即使条件不允许,对于可能产生微粒或气溶胶 的操作(如涡旋、打开真空管等)仍需要在BSC中进行。4.1.4 离心标本离心时需要放在封闭的容器 中,避免气溶胶形成。4.1.5 吸旦应用手工或 电动移液器,严禁用嘴吸量。4.1.6 利器避免使用利器,如针头、玻璃 巴斯德移液管、玻璃容器等。4.1.7 血液溢洒血液溢洒时,立即用合适的试剂擦拭干净,如1:10稀释的新鲜配制的0.71m o l/L次氯酸钠(未稀释的家用漂 白剂)或适当稀释的医用消毒剂。4.
13、1.8 废弃物处理和标本灭活实验室废弃物处置的管理应符合 国家、地方的相关要求,所有不再需要的标本和其他生物材料应弃置于套有生物危险标志的黄色密封且防漏的塑料袋的容器 内,用过的针头等利器应放人利器盒中。实验室标本需要事先灭活处理,将标本与广谱碘伏和漂 白剂混合作用24h 后再进行适 当处理。由于漂 白剂与氯化铵作用可产生有毒的氯气,故漂 白剂不能用于处理含有氯化铵的溶液。3Ws/T360-20114.1.9 固定液0.1%2,0%多聚甲醛或 甲醛缓冲液是常用的固定液,用于对感染的标本在分析前进行灭活,能够灭活H等病毒的3个 5个对数级 的病毒载量。在染色过程中的最后一次离心后,用含有多聚甲醛
14、或 甲醛缓冲液(p H7,0 7,4)处理,4保存待测。建议每周配置新鲜的多聚甲醛或 甲醛缓 冲液。使用含有 罔定液成分的商品化裂解液时,无需再重复使用多聚甲醛或甲醛缓冲液。4.1,10 非固定标本对于非固定标本,实验室应制定合适 的生物安全规则以将感染病原体 的暴露降到最小。由于暴露在空气 中的流式细胞仪液流系统产生的气溶胶具有潜在的危险,所以应提高警惕,严格按照制造商的生物安全建议进行操作。4.1.l l 设备消毒流式细胞仪 的废液桶中需要装有 占其体积1/10的0.71m o l/L次氯酸钠(未稀释的家用漂 白剂)。实验室设备应该用具有灭活传染源作用的溶液或新配制的10%家用漂 白剂消毒
15、,尤其在设备维修和保养前给予严格消毒。4.2 标本标识所有检测用标本应及时贴上标签,标签上应注有患耆的姓名、患者唯一的识别码、检测项 目、标本采集 的 日期和时间,必要时标注检测实验室。如果使用检查 申请单,申请单应和标本粘贴在一起送检,申请单上应标 明患者 的姓名、检测项 目、年龄、性别、标本采集 日期和时间、申请 医生 的姓名和标本类型(如:全血),必要时标注检测实验室。4.3 抗凝剂和采集容器首选乙二胺 四乙酸盐(EDTA-K2/EDTA-K3)抗凝真空管进行标本采集,亦可采用肝素钠抗凝或枸橼酸钠抗凝(ACD)的真空管进行采集,EDTA盐抗凝标本在室温下稳定保存12h 24h,超过30h
16、 的EDTA盐抗凝标本 中粒细胞可能会减少,肝素钠或枸橼酸钠抗凝标本可稳定保存至48h。如果标本用血细胞分析仪 同时进行 白细胞计数和分类,则应该选择EDTA盐作为抗凝剂。4.4 标本质量4.4.1 标本 目视观察可观察到的标本问题常见有两种类型:一是变性或损坏的标本,这需要立即弃之。二是在标本处理过程 中出现错误操作,这需要进行进一步评价。错误操作问题需要记录下来,这对标本 的处理、分析以及结果的解释都很有帮助。4.4.2 溶血严重溶血的标本应该放弃检测,所有可能破坏标本完整性 的异常情况均应密切观察,并且记录下来,以利于后续的处理、分析和结果解释。4,4.3 凝血即使是很小的血凝块也会引起
17、血液中某些成分的选择性丢失或改变,凝血的标本尽可能弃用。4.4.4 温度极限如果标本是通过长距离的路程送到实验室的,标本就有可能暴露在非允许储存温度的环境 中,所以4、Vs/T 360-2011接到标本后应确认标本是否过热或过冷。即使其他所有的鉴定标准都正常,也应记录下来 以利于后续的处理、分析和结果解释。4.4.5 错误标本标签如果标本没有唯一标识或标本标签与患者信息不符(患者姓名与标识不符),应该拒收标本,并及时与相关医护人员沟通。4.4.6 标本保存时间及储存条件可接受的标本最长保存时间取决于抗凝剂的种类、溶血剂、储存条件及细胞浓度。实验室应该根据使用的抗凝剂和溶血剂确定可接受的标本最长
18、保存时间。实验室应选择适 当的保存环境 以及溶血方法,使保存标本的检测结果与新鲜标本之间没有明显差别。原则上标本采集后应该立即检测,但是实际操作 中往往无法做到。不能立即检测的标本应该保存于室温(18 25)环境 中。后续的标本处理和免疫染色应严格按照试剂说 明书进行。4,4,7 标本处理方法采用全血溶血法,以便尽可能地 回收所有的白细胞。但对 于慢性肝病或高脂血症等患者的标本,由于脂质代谢异常导致红细胞脆性下降,溶血素常常无法完全裂解红细胞,需要采用密度梯度离心法;但需要注意的是密度梯度离心法使用密度梯度或冗长的离心步骤,容易导致特殊亚群的不均匀丢失。标本处理的步骤越多,细胞丢失就越多。而这
19、种丢失在 白细胞分类 中的 比例是不均等的。对于全血标本,溶血后不能洗涤,这可以使标本处理的步骤减到最少。4.5 标本运送4.5.1 内部送检同一实验室内转移血液标本,盛放血液标本管的容器应标有生物危险标志,并且在血液标本管有破损的情况下,仍能够容纳标本,可用具有防漏密封层的塑料袋或带有安全盖的塑料容器等。4.5.2 外部送检危险物品运送规定和国际航空运输协会(IATA)危险品规则对含有致病原血液标本 的运送均有相关规定。HIV已被列为UN2814类危险物质,感染级别为6.2。包装应符合UN6.2级别高致病菌性病原体的安全运输包装标准,标准包装要求含有三层体系:a)防水内容器;b)防水并含有吸
20、附材料的第二层内容器;c)坚固的外包装。采集标本应在室温(18 25)环境下尽快送检。5 细胞绝对计数方法5,1 单平台方法5.1.1 白细胞浓度和抗体用且通过计数板计数或使用血细胞分析仪预先计算标本 中的白细胞浓度,并严格按照操作说 明书调整标本和抗体的最佳比例。淋巴细胞过少的标本应减少单抗用量。淋 巴细胞过多的标本应使用含l%白蛋 白或其他蛋 白的磷酸盐缓冲液(PBS)稀释到适 当浓度。Ws/T 360-20115.1.2 移液量标本和荧光微球的移液量应精确,确保准确计数加人的定量微球 的浓度和标本体积。5.1.3 移液次数使用包被有 已知数量的荧光微球的标本处理管,只需移液一次;而直接在
21、标本中加人 已知浓度的荧光微球悬液,需要移液两次。5.1.4 离心为避免荧光微球的丢失,在裂解细胞后不要离心洗涤。5.2 双平台方法淋巴细胞亚群绝对计数 由全血细胞分析仪测定的白细胞计数计算得到,不能使用淋 巴细胞计数进行计算。单平台方法是首选方法,它减轻了室间变异并避免 了多台仪器间的系统误差。6 免疫荧光染色6.1 抗体组合方案6.1.1 联合CD45的四色方案6.1.1.1 CD45/CD3/CD4/CD8检测CD3卞T细胞、CD4+T细胞和CD8十T细胞。6.1.1.2 CD45/CD3/CD19/CD16和(或)CD56检测CD3T细胞、B细胞和NK细胞。6.1.2 联合CD45的三
22、色方案6.1.2.1 CD45/CD3/CD4检测CD3TT细胞和CD4亠T细胞。6.1.2.2 CD45/CD3/CD8检测CD3+T细胞和CD8+T细胞。6.1.2.3 CD45/CD3/CD19检测CD3T细胞和B细胞。6.1.2.4 CD45/CD3/CD16和(蓟DCD56检测CD3+T细胞和NK细胞。6.1.3 双色方案6.1.3.1 CD3/CD4检测CD3+T细胞和CD4+T细胞。6Ws/T 360-20116.1.3.2 CD3/CD8检测CD3T细胞和CD8T细胞。6,1.3.3 CD3/CD19检测CD3T细胞和B细胞。6.1.3.4 CD3/CD16和(蓟DCD56检测
23、CD3T细胞和NK细胞。当检测条件不允许时,也至少要采用CD3与其他直标抗体进行双免疫荧光染色的方案,简称双色方案。不能使用单色方案进行淋巴细胞亚群分析。6.1.4 氨基放线菌素D(7-AAD)联合CD45方案对于超过24h 的标本或肉眼观察发现已经变质的标本,使用7-氨基放线菌素D结合CD45(评估淋巴细胞、单核细胞和粒细胞死亡)复染进行细胞活力 的评估。AAD阴性者为活细胞群,AAD阳性者为细胞膜不完整的死细胞群。对 于不可替代 的或 活力较低 的标本,应采用7-AAD结合6.1.1或6.1.2或 6.1.3的组合方案。6.2 免疫荧光染色6.2.1 标本与抗体孵育适量体积(50u L 0
24、u L)全血标本加人适 量直标抗体(10u L 20u L),室温孵育时间20m i n 301i n。6.2.2 裂解红细胞裂解红细胞的方法与使用的溶血素有关,裂解时间和方法按照所用溶血素说明书进行操作。6.2.3 离心离心洗涤方法与溶血素有关,按照所用溶血素说 明书进行操作。单平 台绝对计数法在裂解红细胞后,不要离心洗涤,并在上机检测前 向待测标本 中加人定量荧光微球。6.2.4 染色后标本保存制备好的标本在上机分析前在40 1o 下避光保存,并在24h 内上机检测,检测前混匀细胞。推荐使用商品化组合抗体的体外诊断试剂。如实验室 自已准备组合单抗,要求在每次试验前新鲜配制。组合抗体 中每一
25、种抗体都需要分别滴定 以明确其噪音与阳性信号的最佳分离滴度,并检测作 为组合抗体使用和作 为组 合抗 体 的成分之一单独使 用 的平均荧 光强度 和 阳性率,其可 比性需 在均值2SD之内。7 对照标本7.1 同型对照淋巴细胞亚群分析不需要同型对照,这是因为CD3、CD4和 CD8阳性细胞独立成群,与阴性细胞群容易区分。、Vs/T 360-20117.2 针对方法学的阳性对照7.2.1 目的监测流式细胞仪上机分析前的环节是否出现问题。由于某种疾病导致方法学 阳性对照的结果在参考范 围之外,不会造成同时处理的其他标本的检测结果 出现错误。由于裂解红细胞不完全或染色效果差,包括阳性对照在内的所有标
26、本都会出现结果偏差。7.2.2 种类全血标本、商品化荧光微球试剂。7,2.3 使用频率每次上机时都需要使用。7.3 评价试剂的阳性对照7.3.1 目的检测新批号试剂和当前批号试剂 的染色效率是否出现问题。当怀疑试剂 出现问题时,采用该试剂与已知可接受性能批号的试剂同时操作进行验证。7.3.2 种类全血标本、冻干淋巴细胞。7.3.3 使用频率更换试剂前后。8 流式细胞仪的质虽控制8.1 验证和调整光路及规范光路设置8.1.1 电压和增益在每次开机时,首先采用荧光微球光路质控品设置和调整仪器光学检测通道的电压和增益,确保其处于厂家或实验室根据特定的实验状态所设定的可接受范围内,并且保持每次开机时仪
27、器性能稳定,对荧光抗体或全血标本最适合。8.1.2 峰值及变异系数调整散射光峰和荧光峰,使之置于相应通道的同一狭小范围内,要求所有光学检测通道所使用的光学参数和荧光参数均为均质峰,其变异系数应符合所用流式细胞仪的技术要求。8.1.3 仪器设置的标准化连续5d 上机测定荧光微球在每个 光学检测通道 的平均通道数和变异系数(CV%),每天共测定4次,然后计算出这些参数的均数()及标准差(SD),以2SD为可接受范 围。当出现偏差时,应查找和解决问题,再进行光路的重新调整。维持上述的仪器设置条件,用于后续的仪器敏感性和荧光补偿设置的监测。8、VS/T 360-20118,2 调整荧光分辨率8,2.1
28、 光路电压采用未加直标抗体但经溶血素裂解 的新鲜全血标本调整光 电倍增管(PMT)电压。未染色淋 巴细胞的 自发荧光应完全在阴性区域,所使用的检测通道 内荧光直方图的淋 巴细胞 阳性率3%时,应重做该管标本,包括重新染色、裂解红细胞和固定等。.5.3 CD4+T细胞和CD8+T细胞相对计数的总和CD4T(CD3CD4_)细胞和CD8T(CD3+CD8t)细胞百分比的总和应该等同于CD3+T(CD3)细胞 的百分 比,变化范围在5%10%。当结果超过上述控制范 围时,考虑标本 中可能包含大量异常T细胞亚群,如TC艮+T细胞,CD3+CD4CD8或CD3+CD4+CD8由m T细胞。9.5.4 定
29、旦微球采集时间的稳定性用于单平 台方法评估绝对计数的准确性。采集时间恒定,提示流式细胞仪的液流系统通畅,定量微球的加人量准确。采集时间不恒定,提示标本制备过程 中出现问题,需要重新制备标本。10 临床意义10.1 CD4+T细胞减少常见于恶性肿瘤、遗传性免疫缺陷症、艾滋病、应用免疫抑制剂等。10.2 CD8+T细胞10.2.1 增多见于系统性红斑狼疮、慢性活动性肝炎、传染性单核细胞增多症、恶性肿瘤及其他病毒感染等。10.2.2 减低见于类风湿性关节炎、糖尿病等。13、Vs/T 360-201110.3 CD4+T/CD8+T比值10.3.1 降 低见于传染性单核细胞增多症、急性 巨细胞病毒感染
30、、再生障碍性贫血、骨髓移植恢复期、肾病等,艾滋病患者的CD4T/CD8_T比值多在0.5以下。10.3.2 增高见于移植后发生排异反应、类风湿性关节炎、糖尿病等。外周血淋巴细胞亚群是监测机体免疫功能的重要指标,主要用于免疫系统疾病及免疫相关疾病诊断和治疗的临床监测。T细胞亚群与细胞免疫功能有关,B细胞与体液免疫功能有关,NK细胞与非特异免疫功能有关。l l 结果报告和审核l 1,1 报告 内容CD3T细胞、CD4T细胞、CD8T细胞、B细胞和NK细胞的相对计数(百分 比)、绝对计数(绝对值)、CD4T/CD8T比值、参考范围及必要的解释和分析。l i.2 审核内容包括数据采集阈值 的设置、采集
31、细胞数和微粒数、散射光模式、抗体组合方案、与试验结果相关的所有设 门等。这些数据均应由实验室专业人员在解释数据时进行审核。l l。3 参考范围每个实验室针对每一型号仪器都应确定本实验室淋 巴细胞亚群分析的参考范 围,成人和儿童应分别建立参考范围。并每年进行验证和调整,每次验证不少于例健康人标本。12 数据储存12.1 储存 内容数据储存和检测数据的方法都应该详细记录,以便于检测者或医师对数据进行复核。对所有要分析的标本数据采用列表模式储存起来,以确保对原始数据进行全面分析。对每个标本 的CD45/SSC淋巴细胞群设门图和显示淋巴细胞亚群的荧光散点图的分析结果应保留纸质文件。数据也可以保存为电子
32、版,但应该做好备份以免硬件或软件 出现故障导致患者数据丢失。室间质评 和室 内质控数据应该包括评估检验系统(仪器和方法)性能的所有参数、分析区域和分析结果。12.2 储存类型数据储存方式多种多样,这主要取决于实验室所用 的信息系统,包括软盘、移动硬盘、光盘和磁带。如果数据 以纸质文件的形式储存,那么得 出报告结果 的所有图形和分析区域(例如淋 巴细胞设 门、分析界限等)都应记录在相应的数据表 中,而且每个标本的数据表都应该有唯一标识。12.3 储存期限至少保 留2年,或根据实验室要求保 留较长时间。储存期过后,实验室监督人员有权利决定继续保14Ws/T 360-2011留或删除数据。13 室内
33、质量控制实验室应开展室内质量控制工作,考虑到中国国情和质控品的成本较高,建议每月至少进行室内质控检测一次。对于特殊实验,如艾滋病CD4T细胞计数,建议至少每周进行一次室 内质控 的检测。进行室内质控品检测前,首先采用健康志愿者 的新鲜外周血标本作为质控物上机测定,一般需要做重复测定。14 室间质评价实验室应参加国内或国外质评机构组织的室间质量评价和能力验证(PT),用于能力验证 的样本必需与病人标本同等对待,要求检验人员和检验流程完全一致。能力验证 的检测结果不能与其他参加能力验证的实验室进行讨论。用于能力验证的样品在任何情况下都不允许转送其他实验室检测或赠与其他实验室。如发生任何失控问题,应
34、积极采取纠正措施预防其再次发生,并记录所有质量保证活动。实验室需要对能力验证时样本的接收、检测前处理、检测、检测后分析与解释、及检测报告等相关资料进行保存。15 人员培训要求流式细胞分析室应具有监督人员和操作人员岗位,并制定用于培训 的标准化操作规程(SOP)。实验室监督人员对每一位操作人员的培训效果、流式细胞术检验能力进行考核并决定是否授权上 岗。监督人员和操作人员应完成流式细胞仪厂家的基本培训 以及专业操作培训班 的定期培训,并跟进政府或地 区对培训和教育的政策措施。Ws/T 360-2011附 录 A(资料性附录)四色抗体组合方案进行淋巴细胞亚群分析的示意散点囡叫00000曩黪 E馕曩
35、桊ICD3l|i|啻宫:蕞饔髯襄|CD3寸Ob)a)0d)曰A。1第1管(A,B,O由CD3,CD19,CD45和 CD56单抗组合染色,第2管(D,E,F)由CD3,Cm,CD8和CD45单抗组合染色。图A。1a):CD45和s s C非设门的白细胞散点图。在此散点图中设定阈值 以排除CD45阴性的细胞碎片,其中Ly 代表淋巴细胞,Mo 为单核细胞,Eo 为嗜酸性粒细胞,Ne 为中性粒细胞,Ba 为嗜碱性粒细胞,He 为前B细胞,My 为髓系早期造血细胞。图A。1b)D:双荧光散点图。在此散点图中,对图A。1a)门内的淋 巴细胞亚群分析,其中也包含少量的单核细胞。主要识别 以下淋 巴细胞亚群
36、:CD3+T细胞亚群(CD3+T),CD3+CD4+T细胞亚群(CD4+T),CD3+CD8+T细珏 亚群(CDs+T),CD3CD19+B细胞(B),CD3_CD56亠NK细胞(NK),CD3+CD56T细胞(CD56+T),CD3CD8+NK细胞(CD8+NK),CD3CD8NK细胞(CD8NK)。璎匣CD45曩婴黠CD8一一一一一曩 一一一丨醐黪婴CD3CD4、Vs/T 360-2011参考文献E1二 CDC,Na t i n a l In s i t u t e s f He a l t h.Bi o s a e t y i n m i c r o b i l。g i c a l a
37、n d b i。m c d i c a l l a b r a t r i e s.Fo u r t h e d i t i n.a s h i n g t o n】DC:US Go v e r n m e n t Pr i n t i n g()f i c e,1999E21 Ca l v e l h T,De n n y TN,Pa x t o n H,e t a l,Gu i d e l i n e f o r f l o w c y t o m e t r i c i m m u n o p h e n o t y p i n g:ar c p o r t f r o r n t h
38、e n a t i o n a l i n s t i t u t e f a l l e r g y a n d i n f e c t i o u s d i s e a s e s,d i v i s i o n f/Il DS.Cy t o m e t r y.1993,14:702-714E3 Ma n d y FF,Ni c h o l s o n JK,Mc Do u g a l JS,CDC.Gu i d e l i n e s f o r p e r f o r m i n g s i n g l p l a t f o r m a b s o l u t e CU4 T-c
39、 e l l d e t e r m i n a t i o n s w i t h CD45g a t i n g f r p e r s o n s i n f e c t e d 厂i t h h u m a n i m m u n o d e f i c i c n c y v i r u s,卜 汀WR Re c。m n Re p.2003,52(RR-2):13E4 Pa x t o n H,Be n d e l e T.Ef f e c t o f t i m e,t e m p e r a t u r e,a n d a n t i c a g u l a n t o n f
40、l w c”m e t r y a n dh e m a t o l o g i c a l v a l u e s。/n n N Y Ac a d Sc i,1993,677:440-443E5彐 Sh i e l d c F,I,Ma n l e t t P,Sm i t h A,e t a 1.St a b i h t y o f h u m a n l y m p h o c y t e d i f f e r e n t i a t i o n a n t i g e n s w h e n s t o r e d a t r o m t e m p e r a t u r e.J
41、Im m u n o l Me t h d s。1983,62:347352E6 Ek o n g T,Ku p e k E,Hi l l H,e t a 1.Te c h n i c a l i n f l u e n c e s o n i m m u n o p h e n o t y p i n g b y f l o w c yt o m e t r y.Th e e f f e c t f t i m e a n d t e m p e r a t u r e o f s t o r a g e o n t h e v i a b i l i t y o f l y m p h o
42、 c y t e s u b s e t s.JIm m u-n l l Me t h o d s,1993,164:263-273E7 Wh i t b y L,Gr a n g e r V,St o r i e I,e t a l。Qu a l i t y c o n t r o l CD4氵T-l y m p h o c y t e e n u m e r a t l o n:r es u l t s f r o m t h e l a s t 9y e a r s o f t h e Un i t e d Ki n g d o m Na t i o n a l Ex t e r n a
43、 l Qu a l i t y As s e s s m e n t Sc h e m e f o ri n n u n e m o n i t o r i n g(1993-2001),Cy t o m e t r y。2002,50(2):102-110E8 Sc h n i z l e i n Bi c k CT,Sp r i t z l e r J,Wk e n i n g CL,e t a l。Ev a l u a t i o n o f Tr u Co u n t a b s o l u t e c o u n tt u b e s f o r d e t e r 1i n i n
44、 g CD4 a n d CD8 c e n u m b e r s i n h u m a n i u u u n o d e f i c i e n c y v i r u s p o s i t i v e a d u l t s.Si t e i n v e s t i g a t o r s a n d t h e NIAID DAIDS n e w t e c h n o l o g i e s e v a l u a u。n g r。u p.Ch n Di a g n La b In m u n o 1.2000,7(3):336-343E9 St o r i e I,Sa w
45、l e A,Gd f e l l o w K,e t a 1.Pe r f e c t c o u n t:a n o v e l a p p r o a c h f o r t h e s i n g l ep l a t f o r m e n u m e r a t i o n o f a b s o l u t e CD4_ T-l y m p h c y t e.Cy t o m e t r y B Ch n Cy t o m,2004,57(1):47-5210 CDC。1997Re 访s e d g o d e l i n e s f o r p e r f o r l u i
46、n g CDd T-c e l l d e t e r m i n a t o n s i n p e r s o n s i n f e c t e d m t hh u m a n i n n m u n o d e f i c i e n c y v i r u s(HIV).46(RR-2)。1997,At l a n t a GAE11 Ge l m a n R,Wk e 血n g C.An a l y s e s o f q u a l i t y a s s e s s m e n t s t u d i e s u s i n g CD45f o r g a t i n gl
47、y m p h c y t e s f o r CD3(+)4(+)%。Cy t。m e t r y。2000,42(1):4E12彐 Nk h o l s o n JK,Hu b b a r d M,Jo n e s BM,Us e o f CD45f l u o r e s c e n c e a n d s i d s c a t t e r c h a r a c t e i s t i c s f o r g a t i n g l y m p h o c y t e s w h e n u s i n g t h e w h o l e b l o o d l y s i s p
48、r o c e d u r e a n d f l o w c y t o m e t r y。Cy t o m e-t r y,1996,26(1):16-21E13 Ni c h o l s o n JK,Jo n e s BM,Hu b b a r d M.CD4T-Iy m p h o c y t e d e t e r m i n a t o n s o n w h o l e b l o ds p e c i!n e n s u s i n g a s i n g l e-t u b e t h r e e c o l o r a s s a y。Cy t o m e t r y.
49、1993,14(6):685-689E14 Sc h e n k c r EL,Hu l t i n LE,Ba u e r KD,e t a l。Ev a l u a t i o n f a d u a l c o l o r f l o w c y t m e t r y i m m u n o p h e n o t y p i n g p a n e l i n a m u l t i c e n t e r q u a h t y a s s u r a n c e p r o g r a m。Cy t o m e t r y,1993,14(3):307-317E15 St e w
50、 a r t CC.Cl i n k a l a p p l i c t/Lt o n o f w c 疒o m e t r y.Im m u n o l o 匪c m e t h o d s f o r m e a s u r h gc e l l m e m b r a n e a n d c y t o p l a s 1i c a n t i g e n s。Ca n c e r.1992,69(6 s u p p l):1543-1552E16 Ma n d y F,Be r g e r o n M,Ho u l e G,e t a 1.Im p a c t o f t h e i
