1、摘要以烘干茄子根为原料，以茄子根总黄酮提取率为指标，利用超声提取茄子根中总黄酮。选取乙醇浓度、超声时间、超声温度、超声功率、液料比为单因素试验，在单因素实验基础上，以响应面实验设计法确定茄子根总黄酮超声提取的最佳工艺条件。结果表明，最佳工艺条件为：乙醇浓度为68%、超声时间为25min、超声温度52超声功率150w液料比21:1（g/ml）,在此最佳条件下，茄子根总黄酮的提取率达 0.836%。关键词： 超声波;提取;茄子根;总黄酮;响应面法;IIAbstractThe eggplant root as raw material, alkaloids in root of eggplant w
2、ith zhe ultrasonicwave assisted alcohol precipitation method. The volume fraction of ethanol、extraction、timeultrasonicwave power、ultrasonicwave temperature、 solid-liquid ratio as the single factor test. The results show that the optimum conditions were: ethanol concentration of 68%、extraction time 2
3、5min、ultrasonicwave temperature is 52、ultrasonicwave power was 150W、the ratio of material to liquid 21:1(ml/g), under these conditions, the extraction rate of total alkaloids from eggplant root is 0.836%.Keywords ultrasonicwave -assisted:extraction; eggplant root; the total alkaloidIV目录摘要IAbstractII
4、1绪论11.1项目的目的及意义11.2国内外研究现状及前景21.2.1国内外研究现状21.2.2超声波辅助提取技术21.3黄酮类化合物41.3.1黄酮化合物的简介41.3.2黄酮类化合物的理化性质41.3.3黄酮化合物的显色反应51.3.4黄酮化合物的药理作用61.4天然药物中总黄酮的提取方法71.4.1有机溶剂提取法81.4.2超声波提取法81.4.3热水提取法81.4.4酶解法81.4.5超临界流体萃取法SFE91.4.6半仿生提取法91.4.7超滤法91.4.8大孔树脂吸附法91.5实验研究主要内容102实验部分112.1实验材料及设备112.1.1实验主要仪器设备112.1.2实验药材
5、及试剂122.1.3主要实验装置132.2实验原理142.2.1茄子根中总黄酮的超声提取142.2.2紫外可见分光光度法原理152.3含量测定的研究方法152.3.1对照品溶液制备152.3.2供试品溶液制备15ii2.3.3标准曲线的绘制162.3.5精密度实验162.3.6稳定性实验172.3.7重现性实验172.3.8含量测定方法总结182.4茄子根总黄酮含量计算182.5单因素试验182.5.1乙醇浓度182.5.2超声温度192.5.3液料比192.5.4超声时间192.5.5超声功率202.5.6单因素实验结果总结202.6响应面实验202.6.1响应面实验设计203结果分析213
6、.1实验结果213.2单因素试验213.2.1不同乙醇浓度对茄子根总黄酮提取的影响213.2.2不同超声温度对茄子根总黄酮的提取率影响223.2.3不同超声时间对茄子根总黄酮的提取率影响223.2.4不同超声功率对茄子根总黄酮的提取率影响233.2.5不同液料比对茄子根总黄酮的提取率影响243.3响应面法对茄子根总黄酮提取条件的优化243.3.2方差分析与显著性检验263.3.3茄子根总黄酮提取工艺的响应面分析273.3.4响应面最优条件的确定344结论35结束语37iv吉林化工学院学士学位毕业论文1绪论1.1项目的目的及意义茄子根,别名茄根,一年生草本至亚灌木,高60-100cm。茎直立、粗
7、壮，上部分枝，绿色或紫色，无南海或有疏刺，全体被星状柔毛。【性状】性状鉴别 商品多已切成小段。主根通常不明显，有的略呈短圆锥表，具侧根及多数错缩综弯曲须根，表面浅灰黄色。质坚实，不易折断，断面黄白色。茎近圆柱形，直径1-2cm，有分枝，表面黄白色至浅灰黄色，有细密纵争皱纹和点状皮孔；叶痕半月形，并有枝条残基或枝痕。体轻，质坚硬，断面不平坦，纤维性，共同白色，中央有淡灰绿色髓部或呈空洞状。气微，味微咸。以身干、色灰黄者为佳。显微鉴别 根黄切面：木栓层2-3列木栓细胞。皮层薄壁细胞含草酸钙砂晶，偶邮方晶。韧皮部狭窄，韧皮纤维断续成环。形成层成环。木质部占大部分，木射线宽1-3列细胞。粉末特征：黄白
8、色。草酸下砂晶细胞众多，内充满草酸钙砂晶。韧皮纤维多断碎，完整者长1768-3536m，直径40-57m，壁厚约16m，或更厚，胞腔大的有的含有的含草酸钙小方晶，纤维一侧壁可见波状弯曲。草酸钙方晶直径7-17m。导管为具缘纹孔，常与木纤维并存1。茄子性味古寒，有散血瘀、消肿止疼、治疗寒热、 祛风通络和止血等功效。 茄子的营养价值很高，其主要成分有葫芦巴碱、 水苏碱、胆碱、 蛋白质、 钙、 磷、 铁及 VA、 VB、 VC，尤其是糖分含量较番茄高1倍，而茄子纤维还含一定量的皂草甙， 并且在紫茄子含有较丰富的 Vpp。它含有极为丰富的生物活性成分黄酮类化合物又称生物类黄酮，是植物经光合作用产生的一
9、大类化合物2。黄酮类化合物是植物代谢过程中产生的一类重要天然有机化合物，对人类的肿瘤、衰老、心血管病等疾病的治疗和预防有重要的意义，并具有良好的市场前景。特别是近30年来黄酮类化合物一直是国内外研究开发利用的热点，是寻找有开发应用前景的先导化合物和生物活性成分的源泉。目前，我国很大一部分高纯黄酮依赖进口，价格十分昂贵。和传统提取黄酮类化合物的方法相比，本实验用超声波法提取茄子根中总黄酮。超声提取法可以节省提取时间、降低劳动强度。所以为更好利用废弃资源，服务于经济，本文研究茄子根中总黄酮的最佳提取条件，为其进一步分离提纯和生产实践应用打下基础2。1.2国内外研究现状及前景1.2.1国内外研究现状
10、黄酮类化合物是存在于自然界的一大类化合物，它具有一定的药学性能，如降低心肌耗氧量、增加冠状动脉及脑血管流量、降血糖、抗氧化、消除体内自由基、抗衰老、增强机体免疫力等功能3-4。天然类黄酮化合物最常见的是黄酮和黄酮醇，其他衍生物还有黄烷醇、查尔酮、双氢黄（醇）、双黄酮、异黄酮、橙酮及新黄酮类等。近年来，人们很热衷于天然植物药的开发，植物药以天然、低毒、绿色、可再生等特点备受青睐。黄酮类化合物以广谱的药理作用已越来越引起人们的注目。目前已知的黄酮类化合物单体已有8000多种，多数具有颜色，在植物体内大部分与糖结合成苷类以配基的形式存在，少部分以游离形式存在。它是以黄酮为母核，同时连有一系列如羟基等
11、的取代基，其基本骨架具有C6-C3-C6。黄酮大多存在于植物的花果、叶、茎、皮及根中，是植物的次生代谢物，在植物界分布比较广泛，主要分布于芸香科、唇形科、豆科、伞形科、银杏科、菊科等5。现在对茄子根总黄酮的工艺研究与工业化提取还比较少，对于原料价格低廉且具有开发价值的茄子根来说很可惜，希望以后有更好的工艺研究进行生产化提取。1.2.2超声波辅助提取技术超声波是指频率为20千赫50兆赫左右的电磁波，它是一种机械波需要能量载体介质来进行传播。超声波在传递过程中存在着的正负压强交变周期：在正相位时，对介质分子产生挤压，增加介质原来的密度;负相位时,介质分子稀疏、离散,介质密度减小。也就是说超声波并不
12、能使样品内的分子产生极化,而是在溶剂和样品之间产生声波空化作用导致溶液内气泡的形成、增长和爆破压缩,从而使固体样品分散增大样品与萃取溶剂之间的接触面积,提高目标物从固相转移到液相的传质速率6。 超声波萃取的原理 超声波萃取中药材的优越性是基于超声波的特殊物理性质。主要是主要通过压电换能器产生的快速机械振动波来减少目标萃取物与样品基体之间的作用力从而实现固-液萃取分离。1 加速介质质点运动,高于20 KHz声波频率的超声波的连续介质例如水中传播时根据惠更斯波动原理在其传播的波阵面上将引起介质质点包括药材重要效成分的质点的运动使介质质点运动获行巨大的加速度和动能。质点的加速度经计算一般可达重力加速
13、度的二千倍以上。由于介质质点将超声波能量作用于药材中药效成分质点上而使之获得巨大的加速度和动能迅速逸出药材基体而游离于水中。2 空化作用 ,超声波法促进了积极的溶解度通过空化作用在植物材料7，在液体介质中传播产生特殊的“空化效应8”，“空化效应”不断产生无数内部压力达到上千个大气压的微气穴并不断“爆破”产生微观上的强大冲击波作用在中药材上使其中药材成分物质被“轰击”逸出并使得药材基体被不断剥蚀其中不属于植物结构的药效成分不断被分离出来。加速植物有效成份的浸出提取。综上所述中药材中的药效物质在超声波场作用下不但作为介质质点获得自身的巨大加速度和动能而且通过“空化效应”获得强大的外力冲击所以能高效
14、率并充分分离出来。1. 超声波萃取的特点 适用于中药材有效成份的萃取是中药制药彻底改变传统的水煮醇沉萃取方法的新方法、新工艺。与水煮、醇沉工艺相比超声波萃取具有如下突出特点 无需高温 在40、50水温F超声波强化萃取,无水煮高温不破坏中药材中某些具有热不稳定易水解或氧化特性的药效成份。超声波能促使植物细胞地破壁提高中药的疗效。常压萃取安全性好操作简单易行维护保养方便。萃取效率高，超声波强化萃取20-40分钟即可获最佳提取率,萃取时间仅为水煮、醇沉法的三分之一或更少。萃取充分萃取量是传统方法的二倍以上。而蒸煮法的蒸煮时间往往需要两到三小时是超声波提取时间的3倍以上时间。每罐提取3次基本上可提取有
15、效成份的90%以上。具有广谱性。适用性广绝大多数的中药材各类成份均可超声萃取。超声波萃取对溶剂和目标萃取物的性质如极性关系不大。因此可供选择的萃取溶剂种类多、目标萃取物范围广泛。减少能耗。由于超声萃取无需加热或加热温度低萃取时间短因此大大降低能耗。药材原料处理量大成倍或数倍提高且杂质少有效成分易于分离、净化。萃取工艺成本低综合经济效益显著 。 2. 超声提取中应注意的问题1 参数的选择在超声提取实验中，选择的参数主要有频率、声强度、提取时间等。实验证明，不同的待提取样品选择不同的参数会出现不同的结果，即使使用同一待提取样品也会因参数的不同，结果不同。所以，超声提取中提高提出率的关键是找到合适的
16、参数。2 溶剂的选择超声提取无需加热，因此，溶剂选择是否得当将会影响到待提取样品中有效成分的提出率。在选择提取溶剂时，最好结合有效成分的理化性质进行筛选，例如在提取环境样品中的重金属，需选用合适的强酸或其混合液；而在提取皂甙、多糖类成分，可利用它们的水溶性特性选择水作提取溶剂；在提取生物碱成分，可利用其与酸反应生成盐的性质而采用酸提的方法。3 对酶的特殊作用低强度的超声波可以提高酶的活性，超声波会使植物细胞产生胞内微声流,提高细胞膜和细胞壁穿透性,从而提高细胞的代谢功能、酶的生物活性,加速酶的催化反应,但不会破坏细胞的完整结构;而高强度的超声波能破碎细胞或使酶失活。在研究超声水浴作用下，淀粉酶
17、和糖化酶对淀粉和糖原水解活性的变化情况时，发现超声使酶的催化活性速率和转化酶对蔗糖水解活性显著升高。而高强度的超声波会抑制酶的活性，甚至使酶失活9。在中草药中存在大量有生物活性的苷类及许多能促进相应的苷酶解的酶。因此，如何在植物有效成分的提取中，利用超声波对酶的双向作用，解决由酶引起的种种问题，有待于今后进一步的研究。 1.3黄酮类化合物1.3.1黄酮化合物的简介黄酮类化合物(flavonoids)指的是两个苯环(A-与B-环)通过中央三碳链相互联结而成的一系列化合物。根据中央三碳链的氧化程度、B-环联接位置(2-或3-位)以及三碳链是否构成环状等特点,可将重要的天然黄酮类化合物分为黄酮类(f
18、lavone)10代表化合物黄岑苷（baicalin）、黄岑素（baicalein），黄酮醇类(flavonol)代表化合物槲皮素（quercetin）、芦丁（rutin），二氢黄酮类(dihy-droflavone)代表化合物陈皮素（hesperetin）、甘草苷（liquiritin），二氢黄酮醇类(dihydroflavonol)代表化合物水飞蓟素（silybin）、异黄酮类(isoflavone)代表化合物大豆素（daidzein）、葛根素（purerarin）等15种。大部分学者认为黄酮的基本骨架是由三个丙二酰辅酶A和一个桂皮酰辅酶A生物合成而产生的,经同位素标记实验证明了A环来自于
19、三个丙二酰辅酶A,而B环则来自于桂皮酰辅酶A。三个丙二酰辅酶A和一个桂皮酰辅酶A在查尔酮合成酶的作用下生成查尔酮,再经过查尔酮异构化酶的作用形成二氢黄酮。其他黄酮类化合物大多是经过二氢酮在各种酶的作用下生物合成而得到。现已发现的黄酮类化合物中,以黄酮醇类最为常见,约占总数的三分之一,其次为黄酮类,占总数的四分之一以上,其余则较少见。黄酮类化合物广泛分布于植物界中,多与糖结合成苷类或以碳糖基的形式存在,也有以游离形式存在的。天然黄酮类化合物母核上常含有羟基、甲氧基烃氧基、异戊烯氧基等取代基,由于这些助色团的存在,使该类化合物多显黄色。黄酮类化合物具有心血管系统维护、抗菌及抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、
20、抗炎、镇痛、保肝等多种生物活性,并且大量研究表明黄酮类化合物还具有降压、降血脂、抗衰老、提高机体免疫力、雌性激素样、泻下、解痉等生物活性。因此黄酮类化合物的研究深受国内外学者的重视。1.3.2黄酮类化合物的理化性质1. 性状黄酮类化合物多为晶形固体,少数化合物(如黄酮普类)为无定形粉末,有较高的熔点,分子结构中,大多带有酚性轻基,因此具有酚类化合物的通性。另外,分子中还常带有毗酮环或碳基,构成了生色团的基本结构,根据轻基的数目,结合的位置与交又共扼体系,构成了黄酮类化合物的呈色。一般来说,黄酮及黄酮醇和其昔类多呈灰黄到黄色。2. 溶解度黄酮类化合物的溶解度,因结构及存在状态(普或营元,单糖普,
21、双糖苷或三糖普)不同而有很大差异。一般游离普元难溶于水,易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酷等有机溶剂及稀碱液中;而黄酮营一般易溶于水、甲醇、乙醇等极性溶剂,难溶于或不溶于苯、氯仿等有机溶剂。3. 显色性黄酮类化合物对盐酸镁粉或汞齐呈鲜红、紫色或黄色反应。结构中带有3-OH,5-OH或邻位轻基者,均能与金属盐类试剂,如铝盐、镁盐、镁盐和铁盐等形成颜色较深的络合物。天然黄酮类化合物多以着类形式存在,并且,由于糖的种类、数量、联接位置及联接方式不同,可以组成各种各样的黄酮。黄酮类化合物大多具有强的荧光,在紫外灯照射下呈现亮黄、黄绿、亮蓝、暗棕等颜色。1.3.3黄酮化合物的显色反应1 还原试验 （1） 盐酸-
22、镁粉（或锌粉）反应：是鉴定黄酮类化合物最常用的颜色反应。 （2） 四氢硼钠（钾）反应：在黄酮类化合物中，NaBH4对二氢黄酮类化合物专属性较高，可与二氢黄酮类化合物反应产生红至紫色。其他黄酮类化合物均不显色，可与之区别。方法是在试管中加入0.1ml含有样品的乙醇液，再加等量2%NaBH4的甲醇液，1分钟后，加浓盐酸或浓硫酸数滴，生成紫至紫红色。 2 金属盐类试剂的络合反应 （1） 铝盐：常用试剂为1%三氯化铝或硝酸铝溶液。生成的络合物多为黄色，并有荧光，可用于定性及定量分析。 （2） 铅盐：黄酮类化合物与铅盐生成沉淀的色泽，可因羟基数目及位置不同而异。例如，乙酸铅只能与分子中具有邻二酚羟基或兼
23、有3-羟基、4-酮基或5-羟基、4-酮基结构的化合物反应生成沉淀，但碱式乙酸铅的沉淀能力要大得多。 （3） 镁盐：常用乙酸镁甲醇溶液为显色剂，本反应可在纸上进行。医学|教育网搜集整理试验时在滤纸上滴加一滴供试液，喷以乙酸镁的甲醇溶液，加热干燥，在紫外光灯下观察。二氢黄酮、二氢黄酮醇类可显天蓝色荧光，若具有C5-OH，色泽更为明显。而黄酮、黄酮醇及异黄酮类等则显黄至橙黄至褐色。（4） 锆盐：多用2%二氯氧锆甲醇溶液。黄酮类化合物分子中有游离的3-或5-羟基存在时，均可与该试剂反应生成黄色的锆络合物。但两种锆络合物对酸的稳定性不同。3-羟基，4-酮基络合物的稳定性比5-羟基，4-酮基络合物的稳定性
24、强（但二氢黄酮醇除外）。故当反应液中加入枸橼酸后，5-羟基黄酮的黄色溶液显著褪色，而3-羟基黄酮溶液仍呈鲜黄色（锆-枸橼酸反应）。 （5） 三氯化铁：水溶液或醇溶液为常用的酚类显色剂。 （6） 氯化锶（SrCl2）：在氨性甲醇溶液中，氯化锶可与分子中具有邻二酚羟基结构的黄酮类化合物生成绿色棕色乃至黑色沉淀。 3 硼酸显色反应：一般在草酸存在下显黄色并具有绿色荧光，但在枸橼酸-丙酮存在的条件下，则只显黄色而无荧光。 4 碱性试剂显色反应：在日光及紫外光下，通过纸斑反应，观察样品用碱性试剂处理后的颜色变化情况，对于鉴别黄酮类化合物有一定意义。1.3.4黄酮化合物的药理作用1. 药理作用1 心血管系
25、统作用（1） 扩血管作用总黄酮具有血管紧张素转化酶抑制剂（ACEI）的作用，抑制血管内皮素（ET）的生成，扩张冠脉血管，改善心肌的血氧供应，对心血管系统起到改善作用，从而起到血管扩张的作用。（2） 抗心律失常作用动物实验表明，黄酮对心肌缺血再灌注损伤组织，可以有效地减少其心律失常发作次数，减轻发作频率，能对抗乌头碱、哇巴因和氯仿诱发的心律失常，其可能的机制为总黄酮可降低心室肌动作电位幅值（APA），延长动作电位时程（APD）。2 抗菌抗病毒11作用（1） 抗病毒活性 黄酮类化合物对多种病毒具有抑制作用，芦丁能抑制流感病毒、脊髓灰质炎病毒。黄芪总黄酮对人疤疹病毒（HSV21）感染的豚鼠皮肤，具有
26、较好的抗病毒治疗效果。异黄芪282甲醚能显著抑制流感病毒。总之黄酮类对于流感病毒、呼吸道合胞病毒、脊髓灰质炎病毒、疤疹病毒、登革热病毒、腺病毒、肝炎病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒等都具有一定的抑制作用。（2） 抗菌作用 甘草黄酮提取物在体外，可有效抑制白色念珠菌、黑根霉、灰葡萄抱、意大利青霉等真菌。同时对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、新型隐球菌、枯草杆菌、绿脓杆菌、烟曲霉菌、白色念珠菌等均有抑制作用，亦能明显抑制的生长。3 抗肿瘤抗癌作用黄酮类化合物对于肿瘤细胞的增长繁殖具有显著地抑制作用。其作用机理为促进抑癌基因表达、诱导肿瘤细胞凋亡、干预肿瘤细胞信号转导、促进抗肿瘤细胞增殖等。黄酮类化合物抗癌抗肿
27、瘤作用的效果，主要体现为具有显著的抗氧化抗自由基作用，且二者之前具有显著相关性，抗自由基及氧化应激的能力强，则抗肿瘤抗癌的作用就会增大12。黄酮类化合物或降低癌基因产物表达量，抑制K-ras、N-ras和H-ras基凶表达，在抑制癌基因表达和促进抑癌基因表达方面具有一定的临床效果。4 对神经系统的作用（1） 镇痛作用 黄酮类化合物有良好的镇痛作用，其作用机制与钙离子拈抗有关，其镇痛作用比吗啡弱，但是强于阿司匹林。芦丁黄酮提取物具有显著的镇痛作用，芦丁可提高小鼠嘶叫刺激阈值，延长小鼠热板舔足反应潜伏期，有效抑制小鼠扭体反应。（2） 抗抑制作用 连翘黄酮化合物对于脑缺血再灌注实验动物模型，有抗抑郁
28、作用，对于绝望实验具有一定的改善作用。（3） 延缓衰老作用 淫羊藿总黄酮可延缓衰老，显著降低脑组织NO含量，提高急性热应激下的应激能力，蜂胶黄酮能说明其可以抑制NO的细胞毒作用，达到延缓衰老之目的。5 生殖系统作用（1） 黄酮类化合物尤其是异黄酮，其化学结构与雌激素类似，具有显著的类雌激素生理作用，其作用机理与天然的雌激素相似，可在体内与天然雌激素竞争性结合，从而直到调节雌性激素其活性的作用。从而延缓或减轻妇女绝经期的各种症状，对于一些与激素依赖性有关的恶性肿瘤疾病如子宫癌、前列腺癌、乳腺癌等具有一定的临床疗效。6 保护肝脏作用（1） 黄酮类化合物对于各种原因引发的肝损伤均有一定的保护作用。如
29、酒精性肝损伤、药物性肝损伤、再灌注性肝损伤、免疫性肝损伤、化学性肝损伤等。藤茶总黄酮对HBsAg和HBeAg的分泌有非常显著的抑制作用；苦菜总黄酮可以减少肝脏谷肌甘肽耗竭，抑制肝脂质过氧化作用，对四氯化碳或是酒精中毒所致肝损伤有明显的保护作用；知母总黄酮具有抑制脂质过氧化和清除自由基的功效，对溴酸钾诱发的肝损伤具有一定的保护作用；黄芪总黄酮对扑热息痛所致肝损伤有保护作用。7 消化系统的作用（1） 甘草叶中的富黄酮成分，具有显著的治疗溃疡病和抑制胃酸过多的作用。高良姜提取的黄酮成份可以显著抑制实验动物的回肠收缩运动，其具有胆碱能受体、H受体介导、钙离子通道或对平滑肌直接起作用。8 抗炎调节免疫作
30、用（1） 黄酮类化合物具有显著的抗炎作用。作用机理为作用于细胞正常的有丝分裂过程，调节细胞间相互作用的分泌过程，抑制肥大细胞和嗜碱性细胞释放慢反应致炎物质，如中性粒细胞溶酶体酶、白三烯、组胺、前列腺素等，调节巨嗜细胞的吞噬功能，从而直到抗炎和免疫调节的作用。穿卜草中分离得到黄酮提取物可显著清除炎性因子，鸡蛋清致大鼠足肿胀、醋酸所致的小鼠腹腔毛细血管通透性增加、二甲苯所致的小鼠耳肿胀等急性炎症反应，都有明显的抑制作用13。1.4天然药物中总黄酮的提取方法黄酮化合物提取的原理是根据相似相容的原理来进行的，过程的实质是黄酮化合物从植物内部向溶剂中转移的传质过程。其中影响黄酮类物质提取的主要因素是由黄
31、酮类物质在所选溶剂中的溶解度大小及其向溶剂扩散的难易程度来决定的。从天然产物中提取有效成分一般使用传统的溶剂提取方法，一般有溶剂热回流法、煎煮法、浸渍法、渗漉法等，这些提取方法主要是通过有效成分在溶剂中的溶解度大小来实现的。传统的提取方法溶剂消耗量大，提取效率低，操作繁琐，提取物质单一，但是由于这些方法对设备仪器的要求比较低，易于推广和转化为工业化生产。随着科学技术的不断发展，新的物理化学提取方法不断出现，物理方法：如超声波提取、微波、超临界流体萃取、高速逆流色谱等；生物化学方法：如酶提取、半仿生提取、分子烙印等14。1.4.1有机溶剂提取法甲醇、乙醇、丙酮是黄酮类化合物提取最合适的有机溶剂，
32、实验室一般采用乙醇为提取溶剂而不选择甲醇、丙酮，主要是由于甲醇、丙酮的毒性比较大。低浓度的醇（60%左右）适合于提取苷类，而高浓度的醇（90%-95%）适合于提取苷元。由于黄酮化合物的结构不同，为了提取得到更多的有效物质，可以选择不同的有机溶剂进行提取。对于苷类和极性较大的苷元，一般可用水、甲醇、乙醇或者极性较大的有机溶剂进行提取，对于大多数黄酮苷元，宜用石油醚、乙酸乙酯、氯仿等极性较低的有机溶剂。范树国15等比较了传统乙醇提取法、水提取法、超声波乙醇浸提法提取喜树中总黄酮的提取效率，发现超声波乙醇浸提法的提取效率最高。1.4.2超声波提取法超声提取法（UE）是利用超声波的机械效应、空化作用和
33、热效应等加速胞内有效物质的释放、扩散和溶解，显著提高提取效率，缩短提取时间的提取方法，并且可以避免高温对提取成分的影响16。另外，超声波提取还可以通过加快溶剂中有效成分的释放扩散，进而提高提取效率，其机理是在反应过程中产生许多次级效应，例如扩散、乳化、生物效应、化学效应等。与传统方法相比，超声波提取具有以下优点：操作温度较低、消耗能量较少、传质速度较快、溶解能力较强、不破坏有效成分等。周燕芳17通过超声波提取法对黄皮叶中的黄酮的工艺条件进行了优化，研究表明：在80%乙醇浓度，40的提取温度，超声处理时间40min,料液比为1:60时，提取效率可以达到3.62%。1.4.3热水提取法极性较大的黄
34、酮苷类物质易溶于水，因此可以使用热水提取法进行提取。例如，朴春红18以水为提取溶剂对荞麦壳黄酮的提取，即通过热水浸渍提取，然后抽滤，即可测量；此方法操作简单，提取过程中没有化学变化和污染，是一种纯天然的提取方法，其缺点是热水提取法耗能量比较大，消耗的时间也较多。1.4.4酶解法对于某些被细胞壁包围的黄酮化合物，一些提取溶剂（如热水、碱、有机溶剂）并不适合于提取，其原因是这些黄酮化合物被细胞壁的纤维素阻碍，导致黄酮化合u提取受阻，提取效率较低。对于这些原料，可以采用酶技术来进行提取，其原理是利用相应的酶充分破坏细胞壁结构中的纤维素与细胞间相连的果胶物质，从而把果胶分解成为小分子物质，使提取过程中
35、传质阻力降低，让细胞中的黄酮化合物完全释放出来，进而提高提取效率。如李会端19用纤维素酶提取紫藤总黄酮，在最佳提取工艺条件下，紫藤果荚中总黄酮的提取率可以达到8.48%，且黄酮化合物的活性依然存在。1.4.5超临界流体萃取法SFE超临界流体萃取(SFE)技术是一种新型的环境友好、高效新型的分离技术。超临界流体既具有气体易于运动和扩散的特点，又具有液体对溶质有较大溶解度的特点，更重要的是超临界流体在选择性分离时非常敏感，其原因是超临界流体的许多性质（如密度、扩散系数、黏度等）随压力和温度的变化很大。超临界流体萃取可以萃取沸点高、难挥发的物质，常用的超临界流体有液态的CO2，其临界温度较低、无臭、
36、无毒。与其他提取方法相比，超临界萃取具有分离和萃取的双重作用，萃取率较高、工艺流程简单、物料无相变过程、耗能较低、没有有机溶剂残留、产品质量好等优点。正是由于超临界流体萃取具有清洁、安全、高效、高质等优点，又被称为“超级绿色”技术。因此超临界萃取技术的应用前景非常广阔。范鲜红20通过CO2超临界流体萃取法提取中药与水蒸气相比较，提取含量、组分有区别，结论SFE技术是一种环境友好、提取生物稳定性和化学稳定性较好的提取技术。1.4.6半仿生提取法半仿生提取法是模仿口服给药在胃肠道的转运过程，采用选定的pH值的水提取，以提取“活性混合体”。该方法将中药或复方的药效物质最大限度地提取出来，能保持原中药
37、或复方中药原有的功效。由于中药进入消化道内在各种酶的作用下发挥其药理作用，因此在半仿生提取法（SBE）基础上发展了半仿生一酶提取法。本文对SBE法的应用进展进行了综述，为中药及其复方的提取工艺研究提供借鉴21。蓝俊峰等22通过研究半仿生提取叶下珠总黄酮的工艺条件，发现在提取时间为1.5h,液料比20:1，温度80，在此条件下，黄酮的提取率为1.505%。1.4.7超滤法本法是以超滤膜两侧的压力差为驱动力,选用不同孔径的膜截流不同分子量物质,来进行超滤分离提取植物中有效成分的一种方法。它可以有效的除去提取液中蛋白质、多糖、高分子单宁以及部分原花色素等杂质。它的特点是在常温下进行、除杂效率高、分析
38、过程中无相变、有效成分理化性能稳定,结果重复性好,准确性高,但同时对超膜的要求也相当高。例如:以银杏叶和绞股蓝为研究对象,利用超滤法对所提取物分子量大小可控的特点,从单味中药提取和双中药提取两个方面考察了银杏叶、绞股蓝两味中药中黄酮的提取效果,并优化超滤提取条件23。1.4.8大孔树脂吸附法吸附树脂是近10年来发展起来的一类有机高分子聚合物吸附剂,它具有物理化学稳定性高、吸附选择性独特、不受无机物存在的影响、再生简便、解吸条件温和,使用周期长、节省费用等诸多优点,避免了用有机溶剂提取分离而造成的有机溶剂回收难、损耗大、成本高、易燃易爆、对环境污染严重等缺点,广泛用于黄酮类物质的提取24。例如:
39、通过正交试验，以木蝴蝶中2种主要黄酮类化合物：木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B质量分数之和为考察指标，考察了药液浓度、pH值、流速等影响HPD100大孔吸附树脂吸附性能的主要因素，确定了最佳吸附条件及解析条件25。随着很多先进技术的产生和发展，在黄酮类化合物的提取方法中，热水提取法、溶剂提取法等方法虽然占据主要地位，但是传统提取方法暴露出了很多问题，例如提取时间长、操作复杂、提取温度高，能量消耗大、提取产物中杂质多、易发生霉变等。而一些新兴的提取技术如超临界萃取、超滤技术、超声波提取法等具有能量消耗低、提取时间短、提取产率高、溶剂无残留等特点。今后黄酮化合物提取的发展方向应该在优化传统方法的基础上，逐渐
40、完善和普及新兴的提取技术。1.5实验研究主要内容这次试验提取茄子根中的总黄酮采用的提取方法为超声波提取法，运用新兴的提取技术，研究中药茄根超声波提取总黄酮的最佳工艺条件，为以后进行工业化提取提供有力的科学依据。首先设计研究实验方法，确认方法可行。其次选出影响实验的单因素条件，并做单因素试验选出优化的提取条件，选取乙醇浓度、液料比、超声温度、超声时间、超声功率做单因素探索实验，利用紫外分光光度法进行分析测定溶液中的黄酮含量，的到较优化的提取条件。随后进行单因素试验结论设计响应面法实验，经过分析，选取乙醇浓度、超声时间、超声温度、液料比做四个因素，做四因素三水平响应面26实验，在利用紫外分光光度法
41、进行分析测定溶液中黄酮含量，得到最佳工艺条件，验证方法准确性。2实验部分2.1实验材料及设备2.1.1实验主要仪器设备表1仪器与设备仪器名称规格、型号生产厂家电子分析天平FA2204N上海箐海仪器有限公司电热恒温鼓风干燥箱DNG9076A上海精宏实验设备有限公司数显恒温水浴锅HH6国华电器有限公司紫外可见分光光度计752N上海菁华仪器科技仪器有限公司超声波清洗机KQ250DE昆山市超声仪器有限公司2.1.2实验药材及试剂表2主要实验药品原料名称规格生产厂家茄子根药材晒干吉林市购无水乙醇分析纯天津市大茂化学试剂厂无水三氯化铝分析纯天津市永大化学试剂开发中心醋酸钠分析纯天津市恒兴化学试剂制造有限公
42、司醋酸分析纯天津市福晨化学试剂厂工业酒精分析纯天津市大茂化学试剂厂芦丁精品实验室镁粉分析纯实验室硝酸铝分析纯天津市大茂化学试剂厂氢氧化钠分析纯天津市北方天医化学试剂厂2.1.3主要实验装置图1超声波清洗器图2紫外可见光分光光度计图3恒温水浴锅2.2实验原理2.2.1茄子根中总黄酮的超声提取本次实验提取方法为超声波辅助提取法，超声波它是一种机械波需要能量载体介质来进行传播。超声波在传递过程中存在着的正负压强交变周期：在正相位时，对介质分子产生挤压，增加介质原来的密度;负相位时,介质分子稀疏、离散,介质密度减小。也就是说超声波并不能使样品内的分子产生极化,而是在溶剂和样品之间产生声波空化作用导致溶
43、液内气泡的形成、增长和爆破压缩,从而使固体样品分散增大样品与萃取溶剂之间的接触面积,提高目标物从固相转移到液相的传质速率。超声波萃取中药材的优越性是基于超声波的特殊物理性质。主要是主要通过压电换能器产生的快速机械振动波来减少目标萃取物与样品基体之间的作用力从而实现固-液萃取分离。本次实验步骤如下：先将干燥的茄子根用枝剪剪成3cm左右的小块，然后再将剪碎的茄子根用粉碎机粉碎，过60目筛24，进行收集存放。实验前先取2.000g左右的茄子根粉末，放在所用提取容器中，用一定体积浓度的乙醇浸泡12小时。提取时，在超声波清洗机上设定温度、时间、功率。超声停止后，趁热过滤，提取两次。经两次提取液混合均匀，
44、取1ml滴加到10ml容量瓶中，再加入2ml三氯化铝溶液，1mlPh-5.2的缓冲溶液，用60%乙醇定容到刻度。同时用60%乙醇代替提取液制作空白试剂，放在40水浴锅中，水浴10min，取出待冷却到室温，用提前去热好的紫外可见分光光度计在272nm处测量吸光度，在用计算浓度，从而计算提取液中黄酮含量。以此方法分别对乙醇浓度、超声时间、超声温度、超声功率、液料比选出最佳条件，进行四因素三水平的响应面实验设计，选出最佳的超声提取茄子根的条件。2.2.2紫外可见分光光度法原理紫外可见光光谱是因价电子在轨道间跃迁而产生的吸收光谱。利用紫外-可见分光光度法对有机化合物进行鉴别的主要依据是多数有机化合物具
45、有特征吸收光谱。物质受光照射后，该物质吸收一定量的一定的光线，未被吸收的光线即投射过来。如果投射光位于可见光区则所看到的物质的颜色是被物质的颜色是被吸收光线的补色。现在广泛用于分析化学上的光的吸收区域，除可见区域外，尚有紫外及红外区域等。通常由于双键、羰基、硝基等所带电子的激发而产生紫外吸收光谱，随着化合物结构不同，其吸收位置和强度会发生改变。在无限连续的电磁波谱中，紫外-可见光区位于X射线与近红外区之间，波长为100800nm，研究物质在紫外-可见光区分子中的生色团和助色团及其共轭情况。利用紫外-可见分光光度法对化合物进行定性鉴别，一般采用对比法。所谓对比法，是将样品化合物的吸收光谱特征与标
46、准化合物的吸收光谱特征进行对照比较；也可以利用文献所载的紫外可见标准光谱进行核对。如果两者完全相同，则可能是同一种；如两者有明显差别则肯定不是同意化合物。在定量上，不仅可以进行单一组分测定，而且可以对多钟混合组分不经分离进行同时测定。应用分光光度法进行定量分析具有快速、灵敏度高以及分析混合物中各组分含量有时不需要事先分离等优点。一般来说，凡是在紫外（或可见）光有较强吸收的物质，或者试样本身没有收，但可以通过化学方法把它转变成为该区有一定吸收强度的物质，那么这些物质都可以进行质量分析，因此紫外（或可见）分光光度法测定的必要条件是试样在 紫外（或可见）区有吸收，并且在测量范围内服从朗伯-比尔定律（Lamber-Beer）定律。即样品在某波长处的吸收强度与所测样品的浓度成正比。符合公式： (公式2-1)A
