1、丹参酮A 对人卵巢癌 A2780 细胞增殖、迁移和自噬的影响李婉玉1，冯晨2，任春慧2，毛艺纯1，张增雷2，冯华1(牡丹江医学院 1病理生理学教研室;2附属红旗医院，黑龙江牡丹江157011)摘要:目的探讨丹参酮A 对人卵巢癌 A2780 细胞增殖、迁移和自噬的影响。方法用不同浓度丹参酮A 作用于卵巢癌 A2780 细胞 24 h，CCK8 法测定不同浓度丹参酮A 对 A2780 细胞增殖的影响，计算其 IC50值;依据 IC50值将卵巢癌A2780 细胞分为 4 个组:0 mg/L 组(即对照组)、03 mg/L 组、06 mg/L 组、12 mg/L 组;应用划痕实验检测丹参酮A 对 A2
2、780细胞迁移能力影响;Western Blot 实验检测丹参酮A 对 A2780 细胞凋亡相关蛋白(Bax、Bcl2)和自噬相关蛋白(Beclin1、LC3、LC3)表达的影响。结果CCK8 实验结果显示，丹参酮A 能够抑制卵巢癌 A2780 细胞的增殖，且抑制作用呈现浓度依懒性，其 IC50值为(297009)mg/L;划痕结果显示，与对照组相比，丹参酮A 能够抑制卵巢癌 A2780 细胞的迁移能力，呈剂量依赖性关系;Western Blot 结果显示，丹参酮A 可抑制 Bcl2 蛋白表达，增强 Bax 蛋白表达，且 Bax/Bcl2 比值增高，自噬相关蛋白 Beclin1 表达增加，LC
3、3/LC3 比值增高。结论丹参酮A 可抑制人卵巢癌 A2780 细胞的增殖、迁移及促进细胞凋亡和自噬的发生。关键词:卵巢癌;丹参酮A;自噬;凋亡;迁移中图分类号:285;73731文献标识码:A文章编号:10017550(2023)01000605基金项目:牡丹江市应用技术研究与开发计划项目(HT2020JG055);黑龙江省省属高等学校基本科研业务费科研项目(2019kyywfmy0033;2019kyywfmy0036)作者简介:李婉玉(1996)，女，硕士研究生，研究方向:肿瘤侵袭转移及耐药机制研究。通讯作者:冯华，副教授，研究方向:肿瘤侵袭转移及耐药机制研究。Effects of Ta
4、nshinone IIA on proliferation，migration and autophagy of human ovarian cancer A2780 cellsLI Wanyu et al(Department of pathophysiology，Mudanjiang Medical College，Mudanjiang 157011，China)Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of Tanshinone IIA on the proliferation，migration and autophagy of huma
5、n ovar-ian cancer A2780 cellsMethodsOvarian cancer A2780 cells were treated with different concentrations of Tanshinone IIA for 24 hThe effect of different concentrations of Tanshinone IIA on the proliferation of A2780 cells was determined by the CCK8 method，andthe IC50values were calculatedOvarian
6、cancer A2780 cells were divided into four groups according to the IC50values:0 mg/L group(iecontrol group)，03 mg/L group，06 mg/L group and 12 mg/L groupThe effect of Tanshinone IIA on the migration ability ofA2780 cells was examined by scratch assayThe effect of Tanshinone IIA on the expression of a
7、poptosisrelated proteins(Bax and Bcl2)and autophagyrelated proteins(Beclin1，LC3 and LC3)was examined by Western BlottingesultsThe results of CCK8 assay showed that Tanshinone IIA inhibitted the proliferation of ovarian cancer A2780 cells，and the inhibitory effect showed con-centrationdependent lazin
8、ess with an IC50value of(297009)mg/LThe scratch results showed that Tanshinone IIA inhibitted themigration ability of ovarian cancer A2780 cells compared with the control group in a dosedependent relationshipWestern Blot resultsshowed that Tanshinone IIA inhibitted the expression of Bcl2 protein，enh
9、anced the expression of Bax protein，and increased the ratioof Bax/Bcl2，increased the expression of autophagyrelated protein Beclin1，and increased the ratio of LC3/LC3 ConclusionTanshinone IIA could inhibit the proliferation and migration of human ovarian cancer A2780 cells and promoted the developme
10、nt ofapoptosis and autophagyKey words:Ovarian cancer A2780 cells;Tanshinone IIA;Autophagy;Apoptosis;Migration卵巢癌发病率居于女性生殖系统恶性肿瘤第二位1，也是妇科恶性肿瘤的主要死因之一。现阶段对于卵巢癌的早期诊断还未取得有效方法，70%80%的卵巢癌患者在确诊时已为晚期2。根据卵巢癌患者确诊时所处的临床分期，选用不同方式给予对症治疗。目前卵巢癌的治疗以手术切除为主，术后辅以化疗、放疗和靶向基因治疗等手段，但是现阶段常规化疗药物毒性大，易产生耐药性，导致患者生活质量下降，短期内可能出现复
11、发3。中药因其对患者副作用小、不产生依赖、经济廉62023 年 02 月牡丹江医学院学报Feb.2023第 44 卷第 1 期JournalofMuDanJiangMedicalUniversityVol.44No.12023DOI:10.13799/ki.mdjyxyxb.2023.01.010价等优势，在卵巢癌治疗上有着较大的优势4。丹参酮A 是从中药丹参中提取的有效成分5，目前在临床上被广泛用于治疗心血管疾病6，现有研究证明丹参酮A 对肿瘤细胞具有明显的抑制作用，但关于丹参酮A 对卵巢癌细胞自噬及凋亡作用的研究相对较少。为了进一步研究丹参酮A 抗癌作用，本研究选用丹参酮A 作用于人卵巢癌
12、细胞株A2780，探讨其是否对卵巢癌 A2780 细胞增殖、迁移、凋亡及自噬产生影响，为其治疗卵巢癌的临床应用提供参考。1材料和方法11材料丹参酮A(美国 Sigma 公司);人卵巢癌 A2780 细胞株(普诺赛生命科技有限公司);CCK8(大连美仑生物技术有限公司);胎牛血清(FBS，维森特生物技术有限公司);Bcl2 一抗、Bax 一抗、Beclin1 一抗、抗微管相关蛋白 1 轻链 3(LC3)一抗(均为万类生物科技有限公司)。12细胞培养待 A2780 细胞复苏后，接种于含有10%FBS、1%双抗(青链霉素)的 1640 培养基中，置于细胞培养箱(37、5%CO2)培养。细胞处于对数生
13、长期进行后续实验。13CCK8 法检测 A2780 细胞活力取对数生长期的 A2780 细胞，调整密度为 1105个细胞/mL，接种于 96 孔板。置于培养箱中培养。设置空白组、对照组、实验设置丹参酮A 不同浓度(04 mg/L、06mg/L、08 mg/L、12 mg/L、16 mg/L、18 mg/L、32mg/L)，每组 6 个复孔。培养 24 h，每孔加入 10 LCCK8 溶液，继续孵育 2 h，在酶标仪波长 450 nm处检测各孔的光密度(OD)值。细胞活力(%)=(实验组 OD空白组 OD)/(对照组 OD空白组 OD)100%。计算丹参酮A 对 A2780 细胞的半数抑制浓度(
14、IC50)。根据 IC50选取低(03 mg/L)、中(06mg/L)、高(12 mg/L)浓度丹参酮A 用于后续试验。14平板克隆形成实验检测细胞增殖能力取A2780 细胞，调整密度为 1103个细胞/mL，接种于6 孔板，加入 2 mL 完全培养基。轻轻转动 6 孔板，将细胞分散均匀，置于培养箱中进行培养。设置对照组、03 mg/L、06 mg/L 和 12 mg/L 丹参酮A药物组，每 3 d 换液;15 d 后每孔加入 2 mL 4%的多聚甲醛固定 15 min，并用结晶紫染色 15 min，统计克隆形成数并计算克隆形成率。克隆形成率=克隆数/接种细胞数100%。15细胞划痕实验检测细
15、胞迁移能力取对数生长期的 A2780 细胞，按 3105/孔接种到 6 孔板中，待细胞密度达 80%90%时进行实验。在 6 孔板底画一条横线，用 200 L 无菌枪头在孔内垂直横线划痕，PBS 缓冲液清洗去除悬浮细胞，0 h 取样拍照，加入不同浓度丹参酮A 溶液(0 mg/L、03 mg/L、06mg/L、12 mg/L)，于倒置显微镜下 48 h、72 h 取样拍照，记录细胞迁移情况，计算其相对迁移率。16Western blot 检测蛋白表达细胞培养，加入不同浓度丹参酮A 溶液(0 mg/L、03 mg/L、06mg/L、12 mg/L)作用 24 h 后，收集 A2780 细胞并用PB
16、S 洗涤 3 次，以 IPA 细胞裂解液在冰上进行裂解 30 min，进行蛋白提取，BCA 法进行蛋白定量，经SDSPAGE 电泳后转移至 PVDF 膜上，在室温下封闭液封闭 2 h，TBST 洗膜，一抗(Bax、Bcl2、Beclin1、LC3)4 孵育过夜。TBST 洗膜 3 次，每次 10min，加入二抗，室温孵育 1 h，TBST 洗膜。显影液 A液和 B 液按 1 1 配置。暗室用 ECL 化学发光法显影，Image J 软件分析灰度值。17统计学分析采用 GraphPad Prism 80 软件和SPSS 250 统计软件，数值变量资料以“均数标准差”表示。采用单因素方差分析(OneWay ANO-VA)，P005 为有统计学意义。2结果21丹参酮A 对人卵巢癌 A2780 细胞活力的影响CCK8 实验结果表明，04 mg/L、06 mg/L、08mg/L、12 mg/L、16 mg/L、18 mg/L、32 mg/L、32mg/L 的丹参酮A 处理人卵巢癌 A2780 细胞 24 h后，与对照组相比，丹参酮A 各剂量组均可抑制A2780 细胞的增殖，呈现浓度依赖性，通过计
