1、海南医学院学报 2023，29（3）Journal of Hainan Medical University丹 皮 酚 通 过 TLR4/MAPK/NFB 通 路 对 LPS 诱 导 的 巨 噬 细 胞RAW264.7损伤的保护作用刘玉龙，孙敏，刘科，颜贵明（安徽中医药大学，安徽 合肥 230012）摘要 目的：探讨丹皮酚对 LPS诱导的巨噬细胞 RAW264.7细胞炎症损伤的保护作用及其机制研究。方法：培养巨噬细胞 RAW264.7，并分成空白组、LPS（1 g/mL）组、丹皮酚（240 mol/mL）组和 TAK242（10 mol/mL）组。采用 CCK8 法检测细胞活性，倒置显微镜观察
2、细胞形态，比色法测定细胞培养液中 GSH、MDA含量，JC-1法检测线粒体膜电位，免疫荧光法检测 F4/80及 p-NF-B蛋白表达分布，Western blotting检测细胞中 TLR4/MAPK/NF-B相关通路蛋白表达。结果：与空白组比较，1 g/mL LPS诱导的细胞活力为0.49720.061（P0.01），接近半数抑制率。与 LPS 组比较，240 mol/mL 丹皮酚预处理的细胞组下调p-NF-B 蛋白表达最显著（P0.01），10 mol/mL TAK242 预处理细胞组抑制 TLR4 蛋白表达最显著（P0.01）。与 LPS 组比较，丹皮酚组细胞形态有所恢复；降低细胞培养液
3、中 MDA 含量、增高 GSH 含量（P0.01）；线粒体膜电位结果中，丹皮酚组红光显著增强，绿光显著减弱（P0.001）；丹皮酚组 F4/80 及p-NF-B 蛋白表达分布显著降低（P0.01），并下调了 TLR4、p-IB、p-p38、p-JNK、p-NF-B 蛋白表达（P0.05）。结论：丹皮酚可改善 LPS 诱导的 RAW264.7 细胞炎症损伤，其机制可能与 TLR4/MAPK/NF-B 通路相关。关键词 丹皮酚；巨噬细胞 RAW264.7；TLR4；NF-B中图分类号 R285 文献标识码 A 文章编号 1007-1237（2023）03-0183-08Protective Eff
4、ects of Paeonol on LPSinduced Macrophage RAW264.7 Injury through TLR4/MAPK/NFB PathwayLIU Yu-long，SUN Min，LIU Ke，YAN Gui-ming（Anhui University of Traditional Chinese Medicine，Hefei 230012，China）Foundation Project：Anhui Natural Science Foundation（2008085MH300）Author：LIU Yu-long，E-mail：.Correspondence
5、 to：YAN Gui-ming，Professor，E-mail：.Received：2022-10-06 Revised：2022-11-29 JHMU，2023；29（3）：183-189View from specialist:It is creative,and of certain scientific and educational value.ABSTRACT Objective：To study the protective effect of paeonol on LPS-induced inflammatory injury of macrophage RAW264.7
6、cells and its mechanism.Methods：Macrophage RAW264.7 cells were cultured and divided into blank group，LPS（1 g/mL）group，paeonol（240 mol/mL）group and TAK242（10 mol/mL）group.The cell activity was detected by CCK8 method，the cell morphology was observed by inverted microscope，the contents of GSH and MDA
7、in cell culture medium were determined by colorimetry，the mitochondrial membrane potential was detected by JC-1 method，the expression distribution of F4/80 and p-NF-B protein was detected by immunofluorescence method，and the expression of TLR4/MAPK/NF-B related path-way protein was detected by Weste
8、rn blotting.Results：Compared with the blank group，the cell viability induced by 1 g/mL LPS was 0.49720.061（P0.01），which was close to the half inhibition rate.Compared with LPS group，the expression of p-NF-B protein in 240 mol/mL paeonol pretreated cell group was down-regulated most significantly（P0.
9、01），and the expres-DOI：10.13210/ki.jhmu.20221201.002网络出版地址：https：/ 安徽省自然科学基金（2008085MH300）作者简介 刘玉龙，E-mail：。通讯作者 颜贵明，教授，E-mail：。收稿日期 2022-10-06 修回日期 2022-11-29 网络出版时间：2022-12-02 17：26：34183海南医学院学报 Vol.29 No.3 Feb.2023sion of TLR4 protein was inhibited most significantly in 10 mol/mL TAK242 pretreated
10、 cell group.Compared with LPS group（P0.01），the cell morphology of paeonol group recovered.Decrease MDA content and increase GSH content in cell culture medi-um（P0.01），In the results of mitochondrial membrane potential，the red light of paeonol group was significantly enhanced and the green light was
11、significantly weakened（P0.001）.The expression distribution of F4/80 and p-NF-B protein in paeonol group decreased significantly（P0.01），and the expressions of TLR4，p-IB，p-p38，p-JNK and p-NF-B protein were down-regulated（P99%）购 自 宣 城 市 百 草 植 物 工 贸 有 限 公 司，货 号（T1903202）；TAK242（TLR4 抑 制 剂）购 自 美 国MedChem
12、express生 物 科 技 公 司，货 号（HY-100523）；CCK8 试剂盒、脂多糖（LPS）购自合肥 Biosharp 生 物 公 司，货 号 分 别（BS350B）（BS904）；胎牛血清购自天津康源生物技术有限公司，货号（KY-01000S）；GSH、MDA 生化试剂盒购自南京建成生物工程研究所，货号分别（A006-1-1）（A003-1-1）；线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）购自北京索莱宝公司，货号（M8650）；p38MAPK 抗体购自 武 汉 三 鹰 生 物 技 术 有 限 公 司，货 号（14064-1-AP）；TLR4 抗体购自美国 Affinity 公司，货 号（A
13、F7017）；NF-B、p-NF-B、p-p38、JNK、p-JNK 抗体购自成都正能生物技术有限责任公司，货 号 分 别（380172）（310052）（310091）（201001）（340810）；电泳仪购自北京六一仪器厂；K3 型酶标仪 购 自 美 国 赛 默 飞 世 尔 科 技 公 司；OLYMPUS-BX81倒置显微镜购自日本奥林巴斯公司。1.2实验方法1.2.1 巨 噬 细 胞 RAW264.7 培 养 将 RAW264.7细胞置于含有 10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的DMEM 培 养 基 中，放 于 37、5%CO2培 养 箱 中培养。1.2.2CCK8法检测不同浓度 LP
14、S处理后的细胞活性将巨噬细胞 RAW264.7 种在 96 孔细胞培养板中，每孔 100 L，细胞种板浓度 3105/mL，24 h 后分别用 0、0.25、0.5、1、2、4 g/mL LPS，每组 3 个平行孔，置于培养箱中 24 h 后，每孔加入 10 L CCK8溶液，继续培养 2 h 后使用酶标仪在 450 nm 波长处检测每孔吸光度。1.2.3Western blotting 筛选丹皮酚及 TAK242 干预浓度将巨噬细胞 RAW264.7 3105/mL 接种于 6孔板中，每孔 2 mL，培养 24 h 后弃掉培养基，将细胞分成 8组，空白组加入 2 mL培养基、LPS（1 g/
15、mL）组加入 2 mL LPS 浓度为 1 g/mL 培养基、丹皮酚各组加入 2 mL LPS 浓度为 1 g/mL 及丹皮酚浓 度 分 别 为 480、240、120 mol/mL 培 养 基，TAK242各组加入 LPS浓度为 1 g/mL及 TAK242浓度分别为 20、10、5 mol/mL 培养基，置于 37细胞培养箱培养 24 h，弃去培养基，加入 PBS 缓冲液清洗 2遍。加入 1 mL PBS溶液，使用细胞刮刀刮下细胞，12 000 r/min 离心 5 min，弃去 PBS，加入含1%PMSF 及 2%磷酸酶抑制剂的裂解液中，提取组织蛋白。煮沸 10 min变性，冷却后电泳。
16、一抗稀释比例 TLR4、NF-B、p-NF-B 均 1 1 000，二抗稀释 比 例（1 5 000）。蛋 白 条 带 显 色 曝 光 后，使 用Image-J软件进行灰度值分析。1.2.4细胞形态观察将巨噬细胞 RAW264.7 3105/mL 接种于 6孔板中，每孔 2 mL，培养 24 h 后弃184刘玉龙等.丹皮酚通过 TLR4/MAPK/NF-B通路对 LPS诱导的巨噬细胞 RAW264.7损伤的保护作用掉培养基，将细胞分成 4 组，空白组加入 2 mL 培养基、LPS（1 g/mL）组加入 2 mL LPS 浓度为 1 g/mL 培 养 基、丹 皮 酚（240 mol/mL）组 加 入 2 mL LPS 浓度为 1 g/mL 及丹皮酚浓度为 240 mol/mL 培养基和 TAK242（10 mol/mL）组加入 2 mL LPS 浓度为 1 g/mL 及 TAK242 浓度为 10 mol/mL 培养基，置于 37细胞培养箱培养 24 h 后，使用倒置显微镜进行拍照（200）。1.2.5细胞培养液中 GSH、MDA 含量检测造模方法同 1.2.4，培养 24 h 后，取出
