1、动物医学进展,2 0 2 3,4 4(2):1 3 7-1 4 0P r o g r e s s i nV e t e r i n a r yM e d i c i n e滇金丝猴尖尾食道口线虫的鉴定 收稿日期:2 0 2 2-0 3-0 5 基金项 目:云 南 省 朱 兴 全 专 家 工 作 站 项 目(2 0 2 0 0 5 A F 1 5 0 0 4 1);云 南 农 业 大 学 兽 医 公 共 卫 生 省 创 新 团 队 项 目(2 0 2 1 0 5 A E 1 6 0 0 1 4)作者简介:陈 越(1 9 6 8-),男,上海人,学士,主要从事圈养野生动物管理工作。谢昕言(1 9
2、9 9-),女,云南曲靖人,硕士研究生,主要从事人兽共患兽医寄生虫病研究。同等贡献作者。*通讯作者陈 越1,谢昕言2,张誉方2,杨建发2,贺君君2,王 昂1,王荣琼3*(1.云南省昆明市五华区昆明动物园,云南昆明6 5 0 0 2 1;2.云南农业大学动物医学院,云南昆明6 5 0 2 0 1;3.云南农业职业技术学院,云南昆明6 5 0 2 1 2)摘 要:云南某动物园发现滇金丝猴肠道线虫感染严重,为进一步确诊感染虫种,通过形态学和P C R方法对其线粒体细胞色素C氧化酶亚基(c o x1)基因部分序列进行扩增、测序和分析,并利用ME GA 6.0软件构建遗传系统进化树,分析其种系发育关系。
3、结果显示,该滇金丝猴虫体样本形态学鉴定结果为食道口线虫,扩增所获得的线虫分离株其c o x1序列长度为4 4 2b p,与尖尾食道口线虫(O e s o p h a g o s t o m u ma c u l e a-t u m)相似度高达9 9.7 4%,表明滇金丝猴体内分离的线虫样本为尖尾食道口线虫。关键词:滇金丝猴;尖尾食道口线虫;线粒体细胞色素C氧化酶亚基基因;种系发育中图分类号:S 8 5 2.7 3 1文献标识码:B文章编号:1 0 0 7-5 0 3 8(2 0 2 3)0 2-0 1 3 7-0 4 滇金丝猴(R h i n o p i t h e c u sb i e t
4、i)是我国特有的一级珍稀濒危保护动物,也是世界自然保护联盟红色名录中的濒危物种。其在系统发育上处于旧大陆猴与猿之间的特殊分类地位,具有极高的科研价值和观赏价值。滇金丝猴消化道易感寄生虫种类较多,常见寄生虫有钩虫、蛔虫、毛首线虫、食道口线虫、肝毛细线虫等1,这些寄生虫严重威胁着滇金丝猴的健康。云南地区某动物园于2 0 2 1年7月救助1头滇金丝猴,次年1月该滇金丝猴出现食欲减退、腹部膨胀的症状,经B超、X光检查确诊该滇金丝猴患有结肠梗阻,对其进行手术后因抢救无效而死亡。对该病猴进行尸体剖检发现其结肠黏膜表面分布有大小相近的纽扣状结节,且结肠段内有大量线状虫体,经形态学观察初步判定为线虫。为进一步
5、确定该滇金丝猴感染的寄生虫种类,将其肠道内的虫体取出进行形态学检测并提取虫体D NA进行分子生物学检测。本研究对滇金丝猴消化道线虫虫体进行形态学和进一步分子生物学检测以及种系发育分析,为滇金丝猴体内线虫的分类、鉴别诊断、分子流行病学调查等研究奠定基础。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 虫体样品 滇金丝猴消化道线虫为2 0 2 2年1月从云南省某动物园采集。1.1.2 主要试剂 琼脂糖粉、d dH2O、1T A E缓冲液、粪便D NA提取试剂盒,均为天根生物科技有限公司产品;G e l S t a i n核酸染料(全式金),丰科生物科技 有 限 公 司 产 品;2P C R M a s t
6、e r M i x、D NAM a r k e rD L20 0 0,均为宝生物工程(大连)技术服务有限公司产品。1.1.3 主要仪器 生物显微镜(B 3 0 2),重庆奥特光学仪器 有限责任 公 司 产 品;P C R仪(P T C-1 1 4 8),B i b b yS c i e n t i f i c公司产品;凝 胶成像系统(WG D-3 0),大韩科学仪器有限公司产品;高速台式离心机(M o d e lC F-1 0),W i s eS p i n公司产品;电子分析天平(B S A 1 2 4 S型),德国赛多利斯公司产品;旋涡混合器(Q L-9 0 1),江苏海门市麒麟医用仪器厂生
7、产;恒温水浴箱(HH-W 6 0 0),深华生物技术有限公司产品;瞬时迷你离心机(M i n i-6 K),湘仪离心机仪器有限公司产品。1.2 方法1.2.1 形态学 用光学显微镜观察虫体样品的形态结构,并拍下虫体图片,进行初步形态学鉴定。样品保存于装有7 0 0m L/L酒精的玻璃瓶中保存备用。食道口线虫的特征为:虫体头部前端有一圆筒形口囊,有膨大头泡与颈沟,颈沟位于腹面,雄虫有发达的交合伞且有一对等长交合刺,雌虫阴门、肛门突出,且肛门后急剧变细2。DOI:10.16437/ki.1007-5038.2023.02.0061.2.2 样品D NA制备 从7 0 0m L/L的酒精保存液中取出
8、单个虫体,用双蒸水反复冲洗3次,置于1.5m L灭菌离心管中;用灭菌的微型剪刀将虫体组织剪碎,反复研磨,根据试剂盒说明书加入2 0 0L缓冲液GA与2 0L蛋白酶K,混匀后将样品置于5 6的水浴锅里消化1 5h1 8h;将消化好的混悬液根据D NA提取试剂盒说明书提取虫体D NA,D NA样品置于-2 0冰箱保存备用。1.2.3 P C R扩增c o x1基因 参照文献3 的报道设计引物,扩增此线虫的c o x1基因,预期扩增的目的 片 段 大 小 约 为4 2 0 b p,上 游 引 物J B 3:5 -T T T T T T G G G C AT C C T GAG G T T T AT-
9、3,下游引物J B 4.5:5 -T AAAGAAAGAA C AT AAT-GAAAAT G-3,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。反应扩增体系在2 5L下进行:上、下游引物各0.5L,模板D NA1L,双蒸水1 0.5L,2P C RM a s t e rM i x1 2.5L。P C R扩增程序:9 45m i n;9 43 0s,5 53 0s,7 21m i n,共3 6个循环;最后7 2延伸5m i n,1 6结束反应。同时设阴性对照。取5LP C R产物进行1 0g/LT A E琼脂糖凝胶电泳,用G e l S t a i n核酸染料染色,紫外投射仪下观察结果,凝胶成像
10、系统摄像。1.2.4 c o x1基因部分序列测定及系统进化树构建 将阳性P C R产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向测序,测序结果进行拼接,并于N C B I进行B l a s t在线比对分析。用ME GA6.0软件构建进化树,以捻转血矛线虫(H a e m o n c h u sc o n t o r-t u s)作为外群,方法为相邻法,B o o t s t r a p置信值重复抽样10 0 0次。2 结果2.1 形态学诊断光学显微镜下观察到虫体前端有膨大的头泡(图1 A),雌虫虫体自肛门之后急剧变细(图1 B),雄虫交合伞发达(图1 C),结合文献和寄生虫图谱4,初步鉴定
11、为食道口线虫(O e s o p h a g o s t o m u m)。A.头泡(1 0 0);B.雌虫尾部(1 0 0);C.雄虫尾部(1 0 0)A.C e p h a l i cv e s i c l e;B.P o s t e r i o re n do f f e m a l e;C.P o s t e r i o re n do fm a l e图1 食道口线虫的显微镜下观察F i g.1 M i c r o s c o p i co b s e r v a t i o no fO e s o p h a g o s t o m u m2.2 P C R扩增样品成功扩增出长度为
12、4 4 2b p的基因片段,与预期c o x1基因目的片段长度相符,且无非特异性条带,空白对照为阴性(图2)。M.D NA标准D L20 0 0;1.样品;-.阴性对照M.D NA M a r k e rD L20 0 0;1.S a m p l e;-.N e g a t i v eC o n t r o l图2 食道口线虫c o x1基因的P C R扩增F i g.2 P C Ra m p l i f i c a t i o no fc o x1g e n e f r o mt h eO e s o p h a g o s t o m u m2.3 c o x1基因部分序列测定及系统进化树
13、构建测序结果显示,扩增获得的线虫c o x1基因序列片段长度为4 4 2b p;比对结果显示,样品与尖尾食道口线虫(O e s o p h a g o s t o m u ma c u l e a t u m)相似度高达9 9.7 4%。用ME GA 6.0软件相邻法构建种系发育进化树(图3)。结果表明,本研究的样本与G e n-b a n k中检索到的登录号为L C 4 2 8 8 1 9.1的尖尾食道口线虫的序列汇在同一小分支,表明样品与来自马来西亚的婆罗洲猩猩体内分离的虫株亲缘关系最近;其次与来自日本的猕猴体内分离出的尖尾食道口线虫分离株与本样品聚在同一大分支,表明其间具有较近的亲缘关系
14、。3 讨论尖尾食道口线虫在金丝猴的寄生虫感染中较为常见。食道口线虫病感染由于对宿主的免疫反应较831动物医学进展 2 0 2 3年 第4 4卷 第2期(总第3 5 6期)弱,生前一般很难做出诊断5,通常患病猴会出现食欲减退或食欲废绝,饮水量增加,稀便甚至会出现血便。尖尾食道口线虫在幼虫时期由小肠黏膜移行至大肠黏膜上,其幼虫在肠黏膜移动时对肠壁造成损伤,通过毒素作用以及机械刺激造成肠壁充血水肿而在宿主猴的大肠内壁上形成结节,这种结节的大量形成可导致宿主消化功能紊乱,吸收功能降低,最后引起宿主猴营养不良和脱水而死亡6。尖尾食道口线虫病有明显季节性,多发于春秋季节7,针对宿主没有明显的性别、年龄差异
15、8。本研究中,该滇金丝猴生前食欲废绝,剖检见结肠外壁有纽扣大小的暗红色结节,结肠内壁有大量白色丝状虫体,长约8mm1 2mm,将虫体取出进行处理后放置光学显微镜下观察,见其头部有发达的交合伞,背板两侧各有一乳突状突起,且有一对等长交合刺,交合刺上有横纹,与前人文献报道感染食道口线虫的临床症状基本一致6,9,可初步鉴定为食道口线虫感染;虫体经P C R扩增c o x1基因1 0后测序比对结果显示也为尖尾食道口线虫,且相似度高达9 9.7 4%,从而进一步判定该滇金丝猴感染了尖尾食道口线虫。本研究样品S a m p l eo f t h i ss t u d y图3 基于c o x1基因构建的尖尾
16、食道口线虫种系发育进化树F i g.3 P h y l o g e n e t i c t r e eb a s e do nO e s o p h a g o s t o m u ma c u l e a t u mc o x1g e n es e q u e n c e s 尖尾食道口线虫的感染通常是由于易感动物食用了被该虫第3期幼虫 污染的 土 壤 或 食 物 引 起的1 0。该虫在宿主体内的潜伏期为5周7周1 1。由于金丝猴是群居动物,当个别猴误食尖尾食道口线虫卵后,通过一起玩耍、进食、抱团等形式,极易增大猴群间尖尾食道口线虫病的传播和感染概率6。本研究中,该滇金丝猴发病距被救助已经过去较长时间,因此推测该滇金丝猴有可能是在园区内误食了携带有感染性幼虫的食物引起发病。由于尖尾食道口线虫的幼虫能使结肠、盲肠段出现纤维包囊化结节,导致患病猴大肠蠕动能力减弱,消化能力下降,最终导致食欲废绝1 2。做好预防措施能够有效的防止尖尾食道口线虫的感染。有文献表明,大部分食道口线虫的感染通常来源于不卫生、过于拥挤的环境中1 3,因此要对滇金丝猴的居住环境进行定期打扫,同时也要注意猴与猴之间的饲
