1、一、课题背景一、课题背景 1 1、尿素的利用、尿素的利用 尿素尿素是一种重要的是一种重要的农业氮肥。农业氮肥。尿素尿素不能直接不能直接被农被农作物作物吸收。吸收。土壤中的细菌将尿素土壤中的细菌将尿素分解成氨分解成氨之后才之后才能被植物利用。能被植物利用。2 2、细菌利用尿素的原因、细菌利用尿素的原因 土壤中的细菌分解尿素是因为它们土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶能合成脲酶 CO(NHCO(NH2 2)2 2 脲酶脲酶 +CO+CO2 2 NHNH3 3 +H2O 3 3、常见的分解尿素的微生物、常见的分解尿素的微生物 芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌
2、、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。也能分解尿素。4 4、课题目的、课题目的 从土壤中分离出能够分解尿素的细菌从土壤中分离出能够分解尿素的细菌 统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌 一一.研究思路研究思路.筛选菌株筛选菌株.统计菌落数目统计菌落数目 1 1、实例：、实例：启示：启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。要求，到相应的环境中去寻找。原因：原因：因为热泉温度因为热泉温度707080800 0C C，淘汰了绝大，
3、淘汰了绝大多数微生物只有多数微生物只有TaqTaq细菌被筛选出来。细菌被筛选出来。DNADNA多聚酶链式反应多聚酶链式反应是是一种在体外将一种在体外将少量少量DNADNA大量复制大量复制的技术，此项的技术，此项技术要求使用技术要求使用耐高温耐高温（93930 0C C）的）的DNADNA聚合酶。聚合酶。.筛选菌株筛选菌株 2、实验室中微生物的筛选原理：、实验室中微生物的筛选原理：人为提供有利于人为提供有利于目的菌株目的菌株生长的条件生长的条件(包括营包括营养、温度、养、温度、pH等等)，同时抑制或阻止其他微生，同时抑制或阻止其他微生物生长。物生长。15.0g15.0g 琼脂琼脂 1.0g1.0
4、g 尿素尿素 10.0g10.0g 葡萄糖葡萄糖 0.2g0.2g MgSOMgSO447H7H2 2O O 2.1g2.1g NaHNaH2 2POPO4 4 1.4g1.4g KHKH2 2POPO4 4 3 3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：从物理性质看此培养基属于哪类？从功能上从物理性质看此培养基属于哪类？从功能上属属于哪类培养基？于哪类培养基？固体培养基固体培养基 在此培养基中哪些作为碳源、氮源？在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：碳源：葡萄糖、尿素葡萄糖、尿素 氮源：氮源：尿素尿素 选择培养基选择培养基 培养基的培养基的唯
5、一氮源为尿素唯一氮源为尿素，只有能合成，只有能合成脲酶脲酶的微的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏缺乏脲酶脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。够选择出分解尿素的微生物。4 4、培养基选择分解尿素的微生物的原理、培养基选择分解尿素的微生物的原理 选择培养基：选择培养基：在微生物学中，将允在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的
6、培养基。止其他种类微生物生长的培养基。back 1 1、显微镜直接计数：、显微镜直接计数：利用利用血球计数板血球计数板，在显微镜下计算一定容积，在显微镜下计算一定容积里里（0.1mm0.1mm3 3）样品中微生物的数量。）样品中微生物的数量。.统计菌落数目：统计菌落数目：左边和顶边及左边的两个顶点 缺点缺点 不能区分死菌与活菌；不能区分死菌与活菌；个体小的细菌在显微镜下难以观察；个体小的细菌在显微镜下难以观察；2.2.间接计数法（间接计数法（活菌计数法）活菌计数法）（1 1）常用方法：）常用方法：每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数(C(CV)V)M M 其中，其中，C C代表某一稀释度下平板
7、上生长的平代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，均菌落数，V V代表涂布平板时所用的稀释液代表涂布平板时所用的稀释液的体积的体积(ml)(ml)，M M代表稀释倍数。代表稀释倍数。1 1个个活菌活菌1 1个个落落菌菌（2）原理：）原理：稀释涂布平板法。稀释涂布平板法。注意事项注意事项 为了保证结果准确，一般选择菌落数在为了保证结果准确，一般选择菌落数在3030300300的平板上进行计数。的平板上进行计数。为使结果接近真实值可将为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出，经涂布，培养计算出菌落平均数。菌落平均数。统计的菌
8、落往往比活菌的实际数目低。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。设置对照的主要目的设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。.设置对照：设置对照：A A同学的结果与其他同学不同，可能同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。的解释有两种。一是由于土样不同一是由于土样不同；二是由于培养基污染或操作失误二是由于培养基污染或操作失误。小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。说服力，对照的设置是必不可少的。方案一：方案一：由其他同
9、学用与由其他同学用与A同学相同土样进行实验同学相同土样进行实验 方案二：方案二：将将A同学配制的培养基在不加土样的情同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。否受到污染。结果预测：结果预测：如果结果与如果结果与A同学一致，则证明同学一致，则证明A无误；无误；如果结果不同，则证明如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养同学存在操作失误或培养基的配制有问题。基的配制有问题。二二.实验的具体操作实验的具体操作 .土壤取样土壤取样 取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。
10、使用前都要灭菌。.制备培养基：制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的制备以尿素为唯一氮源的选择培养基选择培养基。从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土 3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好左右，再取样，将样品装入事先准备好 的信封中。的信封中。应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤10g10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行 分离不同的微生物采用不同的稀释度分离不同的微生物采用不同的稀释度 三三样品的稀释样品的稀释（二）样品稀释（二）样品稀释 （1 1）测）测细菌细菌数：一般用数：一般用10104
11、 4、10105 5、10106 6稀释液稀释液 （2 2）测）测放线放线菌：一般用菌：一般用10103 3、10104 4、10105 5稀释液稀释液 （3 3）测）测真菌真菌数：一般用数：一般用10102 2、10103 3、10104 4稀释液稀释液 原则：确保平板上的菌落数在原则：确保平板上的菌落数在3030 300300之间。之间。.取样涂布取样涂布 实验时要实验时要对培养皿作对培养皿作好标记。注好标记。注明培养时间、明培养时间、稀释度、培稀释度、培养物等。养物等。如果得到了如果得到了2 2个或个或2 2个以上菌落数目在个以上菌落数目在3030300300的平板，的平板，则说明稀释操
12、作比较成功，并能够进行菌落的计数，如则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确验不精确，需要重新实验。，需要重新实验。.微生物的培养与观察微生物的培养与观察 在菌落计数时，每隔在菌落计数时，每隔24h24h统计一次菌落数目。统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。培养不同微生物往往需要不同培养温度。培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌：细菌：303037
13、37培养培养1 12d2d 放线菌：放线菌：25252828培养培养5 57d7d 霉菌：霉菌：25252828的温度下培养的温度下培养3 34d4d。微生物的培养与观察微生物的培养与观察 关注菌落的形态、大小、边缘、隆起程度、颜色、关注菌落的形态、大小、边缘、隆起程度、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。质地等等，都是区分细菌的重要手段。关注菌落的关注菌落的形态、大小、边缘、隆起程度、颜色、形态、大小、边缘、隆起程度、颜色、质地质地等等，都是区分细菌的重要手段。等等，都是区分细菌的重要手段。三、通过三、通过对照试验对照试验进行结果分析与评价进行结果分析与评价 对照组对照组 现象现象 结论
14、结论 未接种的选择未接种的选择培养基培养基 对照的培养皿中无菌对照的培养皿中无菌落生长落生长 未被杂菌污染未被杂菌污染 牛肉膏蛋白胨牛肉膏蛋白胨培养基培养基 牛肉膏培养基上的菌牛肉膏培养基上的菌落数目大于选择培养落数目大于选择培养基上的数目基上的数目 选择培养基具有筛选作用选择培养基具有筛选作用 四四.课题延伸课题延伸 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红酚红指示剂。培养某种细菌后，如果指示剂。培养某种细菌后，如果PHPH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素分解尿素。大肠杆菌呈大肠杆菌呈 黑色中心黑色中心 ,有或无金属光泽
15、有或无金属光泽 大肠杆菌在大肠杆菌在伊红美蓝琼脂伊红美蓝琼脂(EMB)(EMB)上典型特征上典型特征 1.1.使用选择培养基的目的是（使用选择培养基的目的是（）A.A.培养细菌培养细菌 B.B.培养真菌培养真菌 C.C.使需要的微生物大量繁殖使需要的微生物大量繁殖 D.D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别 2.2.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是()A.COA.CO2 2和和N N2 2 B.B.葡萄糖和葡萄糖和NHNH3 3 C.COC.CO2 2和尿素和尿素 D.D.葡萄糖和尿素葡萄糖和
16、尿素 实践训练实践训练 C C D D 3.3.下列说法不正确的是（下列说法不正确的是（）A.A.科学家从科学家从70708080度热泉中分离到耐高温的度热泉中分离到耐高温的TaqDNATaqDNA聚聚合酶合酶 B.B.统计某一稀释度的统计某一稀释度的5 5个平板的菌落数依次为个平板的菌落数依次为M1M1、M2M2、M3M3、M4M4、M5M5，以，以M3M3作为该样品菌落数的估计值作为该样品菌落数的估计值 C.C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度 D.D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。种类最多。4.4.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（加入（）A.A.较多的氮源物质较多的氮源物质 B.B.较多的碳源物质较多的碳源物质 C.C.青霉素类药物青霉素类药物 D.D.高浓度食盐高浓度食盐 B B C C
