1、:./.【基金项目】河南省医学科技攻关计划项目()安阳市科技计划项目重大专项()【作者简介】周福有通信作者男 年 月生博士教授主任医师研究方向:食管癌的外科治疗食管癌的发病机制及防治具核梭杆菌感染对食管癌 细胞紫杉醇化疗抵抗的影响张哲源)刘怡文)付 臻)杨海军)代宁涛)李军扩)孙 蔚)郭艺博)孔金玉)周福有)安阳市肿瘤医院河南科技大学附属安阳市肿瘤医院河南省食管癌精准防治医学重点实验室 河南安阳)河南科技大学临床医学院河南科技大学第一附属医院河南省微生态与食管癌防治重点实验室河南省肿瘤表观遗传重点实验室 河南洛阳 )安阳市肿瘤医院影像科 河南安阳 )安阳市肿瘤医院病理科 河南安阳 )安阳市肿瘤
2、医院胸外科 河南安阳 关键词 具核梭杆菌食管癌炎症小体 肿瘤干细胞紫杉醇化疗抵抗 细胞中图分类号.摘要 目的:探讨具核梭杆菌()感染对食管癌细胞紫杉醇()化疗的影响及其机制 方法:将食管癌细胞 分为 未感染组及 感染组(、和)通过 及 检测各组细胞的 药物半数抑制浓度()及炎症小体 蛋白表达量 构建 敲降的食管癌细胞 然后分为 组、组、组和 组 组 通过 及流式细胞术检测各组细胞系中、乙醛脱氢酶()蛋白表达量及肿瘤干细胞()百分比通过平板克隆、成球实验及 检测各组细胞的体外增殖能力、克隆成球能力及 将裸鼠分为上述 组按分组接种细胞 成瘤后每 尾静脉注射一次(/)共 次 对比各组裸鼠的成瘤能力和
3、瘤体组织中、蛋白表达量及 百分比 结果:与 未感染组相比 感染组(、和)细胞的 及 蛋白表达量均增高(均.)与 组相比 组细胞的 及 蛋白表达量、百分比、体外增殖能力、克隆成球能力、裸鼠瘤体对 的抗性、瘤体内 与 蛋白表达量及 百分比均增高(均 .)而 组细胞上述指标均降低(均 .)与 组细胞相比 组细胞上述指标均降低(均 .)结论:可通过激活 诱导 高表达、富集 降低食管癌细胞对 的敏感性促进其恶性增殖 )().:()().:().().().()().(/).:()(.).(.).(.).(.).:.食管癌发病率与死亡率极高早期临床症状不明显确诊时多发展至中晚期 中晚期食管癌患者最主要的治
4、疗方式之一为化疗其中紫杉醇()为最常用的化疗药物但易产生耐药 因此探明 的耐药机制对于改进食管癌治疗方案、改善食管癌患者预后至关重要 本团队前期研究已证实具核梭杆菌()的长期定植不仅可重塑肿瘤微环境削弱机体抗肿瘤免疫反应还可促进肿瘤细胞葡萄糖代谢为其恶性增殖提供能量 虽然 在食管癌中的致病机制有待进一步探讨但本团队已证实 感染可导致食管癌患者预后不良 研究表明固有免疫系统在机体抵抗病原微生物入侵时发挥重要作用而炎症复合体为机体固有免疫系统的重要组成部分其中核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白()是炎症复合体中最具特征性的多聚体蛋白复合体多种病原微生物均可通过活化 诱导促炎因子成熟并分泌到胞外调控免
5、疫应答引发炎症反应为自身长期定植提供有利条件且 的活化可使肿瘤干细胞()干性增强 有研究显示 为肿瘤耐药、复发和转移的根源对各种治疗均具有抗性且乙醛脱氢酶()已被证实可作为食管癌优选的干细胞标记物 本研究首先建立 敲降的食管癌细胞系用 分别感染亲本与敲降细胞系探讨 对食管癌细胞中 的调控机制然后通过 干预裸鼠皮下荷瘤实验研究 感染导致 化疗抵抗的系统机制为食管癌的临床治疗提供新思路 材料与方法.细胞、主要试剂与仪器人食管癌 细胞系(上海博谷生物科技有限公司)细胞系(中国医学科学院)标准菌株(美国路易斯维尔大学捐赠)脑心浸液培养基(法国梅里埃公司)、体积分数 无菌脱纤维绵羊血、体积分数 氯化血红
6、素和 /维生素(中国索莱宝科技有限公司)胎牛血清(美国 公司)与 培养基(美国 公司)敲降质粒及慢病毒包装试剂盒(美国 公司)试剂盒(加拿大 公司)级/雄性裸鼠中国常州卡文斯实验动物有限公司动物许可证号:(苏)荧光素酶检测试剂盒(德国 公司)试剂盒(日本同仁化学研究所)(美国 公司)与 兔抗人单克隆抗体(美国 公司)兔抗人单克隆抗体、山羊抗兔、蛋白定量试剂盒及 发光显影液(中国康为世纪生物科技有限公司)凝胶成像系统(美国 公司)厌氧工作站(美国 郑州大学学报(医学版)年 月 第 卷 第 期公司)流式细胞仪(美国贝克曼公司)酶标仪及 小动物活体光学成像系统(美国珀金埃尔默公司).敲降食管癌细胞系
7、的构建 于 、体积分数 的培养箱常规培养 细胞待密度为 时开始转染 采用慢病毒包装试剂盒将 敲降质粒()配制为 混合物具体步骤参照说明书进行 将混合物加入 细胞中 后收取病毒上清.滤器过滤去除细胞碎片 待 细胞密度至 时加入病毒上清进行转染嘌呤霉素筛选 周 提取细胞蛋白质通过 检测 敲降效率 将 敲降后的细胞命名为.食管癌细胞的 感染于厌氧工作站(体积分数 、和 )中常规培养 培养基为含体积分数 无菌脱纤维绵羊血、体积分数 氯化血红素和 /维生素 的脑心浸液培养基 具体培养方法及纯度鉴定方法参 照 本 课 题 组 前 期 研 究 待 及 细胞密度为时将对数生长期 菌液加入细胞培养基(感染复数
8、)感染不同时间(、和)将 感染 后的两种细胞命名为 及 .各组细胞和瘤体组织中 及 蛋白表达的检测提取 未感染组和 感染组(、与 )细 胞 蛋 白 以 及、和 组细胞及裸鼠瘤体组织蛋白 用 蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度 样本(总蛋白/泳道)于 /聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并转移至 膜 含 /脱脂牛奶液的 室温封闭 、(按 稀释)和(按 稀释)抗体 孵育过夜山羊抗兔(按 稀释)孵育 用 发光显影液于凝胶成像系统中检测目的蛋白条带 软件测定蛋白条带灰度值以目的蛋白与内参蛋白灰度值比值为最终蛋白相对表达量 实验重复 次.各组细胞 的 检测采用 试剂盒检测:未感染组及 感染组(、和 )细胞的 药物 组、组、
9、组及 组细胞的 药物 每组细胞均于 孔板中配制 细胞悬液(每孔 个细胞)至培养箱预培养 (、体积分数)每组均设置 个对照孔及不同质量浓度的实验孔(.、.、.、.、./)按质量浓度分别加入 培养 每孔加入 试剂 后更换为新鲜培养基酶标仪测定 计算 实验重复 次.各组细胞体外增殖能力的平板克隆检测将、和 组细胞分别接种于 孔板每孔 个细胞常规培养 周 当出现肉眼可见的克隆时终止培养弃去培养基 经 冲洗、体积分数 甲醛固定、结晶紫染色后拍照并计数克隆数 实验重复 次.各组细胞克隆成球能力的成球实验检测将、和 组细胞配制成单细胞悬液每组取 个细胞于低吸附皿中悬浮培养 周当出现肉眼可见的克隆球时终止培养
10、对直径 的克隆球进行拍照计数 实验重复 次.各 组 细 胞 中 的 百 分 比 检 测 将、和 组细胞用 检测缓冲液调整至 个/每组抽取 细胞悬液放入检测管()并于对照管()加入 二乙氨基苯甲醛()于检测管的细胞悬液中加入 试剂混匀并抽取.混合物加入对照管 孵育 后离心弃上清留取细胞沉淀 用.检测缓冲液重悬细胞沉淀并于流式细胞仪上检测 以检测管与对照管中 百分比的差值为最终 百分比 实验重复 次.各组细胞成瘤能力的裸鼠皮下荷瘤实验选择 只 周龄健康 级雄性/裸鼠(约 )为实验对象 于温度为()且湿度为 的 级鼠笼饲养 自然昼夜照明 裸鼠自由进食、饮水(饲料、饮水均为 级)适应性饲养 周后随机分
11、为 组每组 只 用荧光素酶标记、和 细胞然后按分组于每只裸鼠右侧腋下接种标记后的细胞(个)接种 周后待各组裸鼠肿瘤长至直径约 按/的剂量尾静脉注射 次共给药 次 末次给药 后由 小动物活体成像仪拍摄并检测肿瘤大小然后采用深麻醉下颈椎脱臼法处死小鼠并将瘤体剥离称重 称重后将瘤体研磨一部分提取新鲜组织蛋白检测各组裸鼠瘤体内 ().及 蛋白的表达情况另一部分配制成单细胞悬液检测各组裸鼠瘤体内 百分比方法同前.统计学处理采用 .进行数据处理 应用两独立样本 检验比较 组细胞与 组细胞中 蛋白表达量的差异 应用单因素方差分析和 检验比较未感染组及 感染组(、与 )细胞的 药物 及 蛋白表达量的差异 组、
12、组、组及 组细胞中 及 蛋白表达量、百分比、体外增殖能力、克隆成球能力、药物 及裸鼠成瘤能力的差异 检验水准 .结果.敲降的 细胞系的建立见图 结果显示与 细胞(.)相比 细胞中 蛋白表达量(.)降低(.)提示成功建立 敲降的 细胞系:细胞:细胞图 两组细胞中 蛋白的表达.感染对 细胞的 应答效力及 蛋白表达的影响 见图、表 由图、表 可知各 感染组细胞的 及 蛋白表达量均高于 未感染组且两指标随 感染时间的延长而逐渐增高(均.).感染及 敲降对 细胞中、蛋白表达及 百分比的影响见图 和表 与 组相比 组细胞的、蛋白表达量及 百分比均增高(均.)而 组细胞上述指标均降低(均.)与 组细胞相比
13、组细胞上述指标均降低(均.):未感染组:感染 组:感染 组:感染 组:感染 组图 各组细胞中 蛋白的表达表 各组细胞的 及 蛋白表达的比较()组别/(/)蛋白 未感染组.感染 组.感染 组.感染 组.感染 组.:两两比较 均.:组:组:组:组图 各组细胞中、蛋白的表达表 各组细胞中、蛋白和 百分比比较()组别 蛋白 蛋白 百分比/组.组.组.组.:与 组比较.:与 组比较.感染及 敲降对 细胞体外增殖能力、克隆成球能力和 应答效力的影响见图、图 和表 与 组相比 组细胞的体外增殖能力、克隆成球能力及郑州大学学报(医学版)年 月 第 卷 第 期均增高(均.)而 组细胞上述指标均降低(均.)与 组
14、细胞相比 组细胞上述指标均降低(均.):组:组:组:组图 各组细胞体外增殖能力的平板克隆检测结果:组:组:组:组图 各组细胞克隆成球能力的成球实验检测结果表 各组细胞体外增殖能力、克隆成球能力和 的比较()组别平板克隆数/个克隆球数/个/(/)组.组.组.组.:与 组比较.:与 组比较.感染及 敲降对裸鼠 化疗敏感性的影响 见表 由表 可知与 组相比 组裸鼠成瘤能力增强(.)而 组裸鼠成瘤能力减弱(.)提示此组裸鼠瘤体对 化 疗 敏 感 性 增 强 与 组相比 组裸鼠成瘤能力减弱(.)提示 感染并不能增强 组裸鼠对 化疗的抗性.各组裸鼠瘤体内、蛋白表达及 百 分 比 的 比 较 结 果 见 图
15、、表 与 组相比 组裸鼠瘤体中、蛋白及 百分比均增加(均.)而 组裸鼠瘤体中、蛋白及 百分比减少(均 .)与 组相比 组裸鼠瘤体中、蛋白及 百分比减少(均.)表 各组裸鼠肿瘤荧光强度和肿瘤质量比较()组别肿瘤荧光强度/肿瘤质量/组.组.组.组.:与 组比较.:与 组比较.:组:组:组:组图 各组裸鼠瘤体内、蛋白的表达 ().表 各组裸鼠瘤体内、蛋白表达及 百分比的比较()组别 蛋白 蛋白 百分比/组.组.组.组.:与 组比较.:与 组比较.讨论化疗为中晚期食管癌患者最主要的治疗方式之一其中 为最常用的一线化疗药物 可促进微管蛋白聚合使癌细胞生长停滞于有丝分裂期从而有效抑制其恶性增殖但多数患者治
16、疗后均会产生不同程度耐药导致后续治疗效果不理想因此探明食管癌 耐药的分子机制对改进食管癌治疗方案、提高临床疗效具有极其重要的意义研究表明口腔条件致病菌 可通过多种途径诱导肿瘤细胞化疗抵抗并促进其恶性增殖:可通过激活结肠癌细胞中 导致结肠癌奥沙利铂及氟尿嘧啶化疗抵抗 可通过上调 介导的 促进口腔鳞癌细胞顺铂耐药还可通过引发 细胞自噬潮降低其对 氟尿嘧啶、顺铂及紫杉醇的敏感性 本团队前期研究已证实 感染阳性的食管癌患者术后生存时间显著缩短且 感染可降低食管癌细胞对 的应答效力 本研究发现随 感染时间的延长升高食管癌细胞 对 的应答效力逐渐减弱提示 可诱导食管癌细胞 耐药但耐药的具体分子机制尚不完全
17、明确宿主抵抗病原微生物入侵的第一道保护屏障为机体的固有免疫系统其主要成分为炎症复合体 炎症小体是炎症复合体中最具特征性的多聚体蛋白复合体可识别多种病原微生物活化 以介导 和 等促炎因子释放到胞外从而调节免疫应答并引起炎症反应 病原微生物的持续感染可激活 炎症小体参与多种肿瘤的恶性演进:牙龈卟啉单胞菌可通过活化造血 炎症小体招募骨髓细胞重塑促炎性肿瘤微环境诱导结直肠癌的发生发展 病毒可介导宿主细胞中 蛋白与高迁移率族蛋白 结合维持自身裂解信号促进伯基特淋巴瘤的恶性进展 本研究发现随 感染时间的延长食管癌细胞 中 蛋白表达量逐渐增高提示 可诱导食管癌细胞中 高表达且具有时间依赖性资料显示抑制 炎症
18、小体的过度激活可增强多种恶性肿瘤对化疗药物的应答效力:抑制非小细胞肺癌中 活性可重新激活顺铂诱导的细胞焦亡增强癌细胞对顺铂的敏感性阻断口腔鳞癌中 信号通路可减弱 氟尿嘧啶诱导的干性富集增强其治疗效果 由于 可无限增殖、多向分化且可抵抗常规放化疗因此被认为是肿瘤耐药、复发和转移的根源 的分选已成为肿瘤治疗的关键 研究已证实是食管癌优选的 标志物参与基因表达、组织分化和维持内环境稳定等功能 本研究发现 感染可引起 组细胞中 蛋白及 百分比均显著增高提示 可诱导食管癌细胞中 蛋白高表达引起 大量富集 为探索 在 致病机制中发挥的作用本研究建立 敲降的 细胞系发现 敲降时 组细胞中 蛋白及 百分比均随
19、之减少 而 感染 敲降的 组细胞时并不能引起 蛋白及 百分比增高提示 为食管癌细胞中 诱导 富集过程中的关键调控因子本研究还发现 感染时 组细胞的体外增殖能力、克隆成球能力及 均显著增高提示 可增强食管癌细胞的干细胞样特性并降 低 其 对 的 敏 感 性 敲 降 后 组上述指标均随之降低提示食管癌细胞中 的激活与干细胞样特性的维持密切相关 而 感染 敲降的 组细胞时并不能引起其上述指标增高提示 在 诱导的食管癌细胞干细胞样特性增强及 化疗抵抗过程中发挥重要作用本研究的裸鼠皮下荷瘤实验结果显示 与 组相比 组裸鼠成瘤能力及瘤体内、蛋白与 百分比均增高提示 可通过激活 诱导食管癌细胞 高表达引起
20、大量富集导致 治疗抵抗而 组裸鼠上述指标均降低提示 的敲降可抑制食管癌细胞 表达导致 减 少 对 治 疗 的 敏 感 性 增 强 与 组相比 组裸鼠成瘤能力及瘤体内、蛋白与 百分比均减少提示 的敲降阻断了 引起的 郑州大学学报(医学版)年 月 第 卷 第 期化疗抵抗表明 为食管癌细胞中 感染引起的 化疗抵抗中的关键调控因子综上所述 可通过激活 诱导食管癌细胞 高表达引起 大量富集导致 化疗抵抗最终促进食管癌细胞恶性增殖 有效清除 并抑制 的活性可能为食管癌治疗提供新策略和治疗手段参考文献 张哲源刘怡文付臻等.具核梭杆菌对炎症小体 的诱导作用对食管鳞状细胞癌患者生存期的影响.郑州大学学报(医学版
21、)():.()():.:.():.:王敏刘怡文原翔等.具核梭杆菌诱导葡萄糖转运蛋白 高表达在食管鳞癌组织中的临床意义及预后价值.中山大学学报(医学科学版)():.()():.():.():.():.():.():孔金玉原翔刘怡文等.在食管鳞癌组织中的表达及与预后的关系.食管疾病():.():.():梅家转徐虹刘桂举等.顺铂和紫杉醇对 细胞杀伤食管癌细胞活性的影响及其分子机制研究.中国肿瘤临床():.():柏效治原翔刘怡文等.组蛋白赖氨酸去甲基化酶 对卵巢癌 细胞恶性生物学行为的影响.实用医学杂志():.():.():.:.:.:.():.():.():.().():.():.()().():.
22、():.().():(收稿 责任编辑赵秋民):./.食管鳞状细胞癌脑转移危险因素分析陈培楠)韩文莉)白合林)宋 昕)赵学科)乔佳欣)韩雪娜)范宗民)王 苒)李 贝)罗 宏)黄炳文)王立东)郑州大学附属肿瘤医院(河南省肿瘤医院)胸外科 郑州 )郑州大学第一附属医院省部共建食管癌防治国家重点实验室 郑州 )光山县人民医院 河南信阳 关键词 食管鳞状细胞癌脑转移临床病理特征危险因素中图分类号.摘要 目的:探讨食管鳞状细胞癌(食管鳞癌)脑转移的危险因素 方法:回顾性分析来自省部共建食管癌防治国家重点实验室食管/贲门癌临床诊疗、病理和随访信息数据库中 例食管癌脑转移术后患者的资料采用倾向性评分匹配法选取 例未发生脑转移的食管鳞癌患者比较两组的临床病理特征使用条件 回归分析筛选食管鳞癌脑转移的危险因素 结果:与非脑转移组比较食管鳞癌脑转移组低分化患者比例较大淋巴结转移阳性率较高(.)条件 回归分析结果显示淋巴结转移阳性是食管鳞癌脑转移的危险因素()为.(.)结论:淋巴结转移阳性是食管鳞癌脑转移的危险因素 ):().【基金项目】国家自然科学基金面上项目()河南省医学科技攻关计划项目()河南省肿瘤医院博士启动资金资助项目()【作者简介】王立东通信作者男 年 月生博士教授研究方向:食管、贲门癌变机制及防治郑州大学学报(医学版)年 月 第 卷 第 期
