1、衰老的细胞结构学根底，如何调控细胞的衰老的相关实验：Senescence is an autonomous property of normal cells，Hayflick and Moorhead, 1965，是通过用40次分裂的male细胞和10次分裂的female细胞来比拟，30次后只有female细胞存在。衰老细胞特征：大多变大，运动性降低，饱和密度减少；衰老细胞不同于在G0期的静止细胞，因为衰老是不可逆的；衰老细胞抵抗凋亡，这就解释了为什么衰老细胞没有被去除而是积累老化。衰老细胞的标志：senescence markers：SA-Bgal and DDR signaling1，本质
2、上不可逆的生长停滞；2，细胞增大；3，表达衰老相关的半乳糖苷酶;4，通过活化pRB，表达p16INK4a，导致形成衰老相关的异染色质聚点SAHF：K9M-H3, HP1, and Rb5，衰老细胞通过持久的DDR信号来分泌生长因子，蛋白酶，CK和其他因子。6，细胞开始衰老，用持久的DDR信号来庇护DNA片段，用染色体修改来增强衰老聚点，包括已活化的DDR蛋白。细胞衰老的特征：研究说明，衰老细胞的细胞核、细胞质和细胞膜等均有明显的变化： 细胞内水分减少，体积变小，新陈代谢速度减慢；细胞内酶的活性降低；细胞内的色素会积累；细胞内呼吸速度减慢，细胞核体积增大，核膜内折，染色质收缩，颜色加深。线粒体数
3、量减少，体积增大； 细胞膜通透性功能改变，使物质运输功能降低。衰老细胞的形态变化表现有：1、核：增大、染色深、核内有包含物2、染色质：凝聚、固缩、碎裂、溶解3、质膜：粘度增加、流动性降低4、细胞质：色素积聚、空泡形成5、线粒体：数目减少、体积增大6、高尔基体：碎裂7、尼氏体：消失8、包含物：糖原减少、脂肪积聚9、核膜：内陷自由基与衰老：自由基是一类瞬时形成的含不成对电子的原子或功能基团，普遍存在于生物系统。其种类多、数量大，是活性极高的过渡态中间产物，正常细胞内存在去除自由基的防御系统，包括酶系统和非酶系统。前者如：超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化氢酶(CAT)，谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-P
4、X)，非酶系统有维生素E，醌类物质等电子受体。 自由基的化学性质活泼，可攻击生物体内的DNA、蛋白质和脂类等大分子物质，造成损伤，如DNA的断裂、交联、碱基羟基化。蛋白质的变性而失活，膜脂中不饱和脂肪酸的氧化而流动性降低。超氧化物岐化酶与抗氧化酶的活性升高能延缓机体的衰老。细胞衰老与肿瘤抑制：1，细胞衰老取决于至关重要的两个强有力的肿瘤阻抑通路：p53和 pRB/p16INK4；2，任一通路的缺失都可能导致细胞衰老，并且极大可能增加组织的癌症；3，恶化前的结肠腺癌细胞表达衰老标志，包括SA-Bgal和DDR信号；但是衰老在结肠腺癌中明显减少4，同样，在致癌基因Ras表达或Pten敲出的鼠模型中
5、，衰老细胞大多是癌前病变的，但是即使开展下去也很少形癌症。5，通过失活p53来解除衰老响应，导致显著的加速形成恶性肿瘤。6，回应化疗，或重新活化p53，衰老响应是与肿瘤抑制相关滴。端粒与衰老：细胞复制的失败可能是由于端粒受损：端粒位于染色体末端的高度重复的DNA区域；它们可以阻止末端染色体在复制的时候连接在一起；DNA聚合酶不能完全复制端粒；端粒随着每次细胞分裂就变短一次除非被端粒酶维持；最终细胞不能复制，经历复制衰老。IPS与ES比拟：ES是胚胎干细胞iPS是诱导多能干细胞 1来源不同 一个是来自胚胎，一个是来自已经分化的体细胞。2获得个工艺不一样，ES直接从胚胎提取，ips是通过体细胞导入
6、一些基因诱导产生。3能力不同，ES比ips的能力要强，ips对于局部细胞分化有局限性，ES有更好的全能性。4ES使用中有伦理观念的限制，而ips不存在这个问题，他可以用自身的体细胞诱导产生。跳过伦理观念的限制。5.ES细胞全能性的机制：Oct4, Sox2 and Nanog form an interconnected auto- regulatory network。iPS细胞重编成的机制：外源Oct4和Sox2重新活化的内源的Oct4，Sox2和Nanog和它们的自我调节环，然后就自我维持。外源因子通过DNA甲基化被沉默。6.iPS细胞的免疫原性:要比ES细胞好，可以造成肿瘤抑制。IPS
7、制作：诱导多能性：两阶段转化Stage1，由体细胞到局部重编成细胞：下调系基因；活化ES细胞的特殊基因；染色体在多能基因处重构Stage2，由局部重编成细胞到iPS细胞：自我调节环的复苏；ES细胞转录网络的全部活化；彻底的转录基因的沉默别离体细胞，体外培养5-6代；通过转基因导入重编程基因；在筛选培养基中筛选培养10-30天；挑取克隆，扩增形成iPS细胞系；iPS细胞鉴定(外表标志物、分化全能性)等。IPS细胞的潜力：能够分化成多种细胞类型容易获取个体特异性如个人的或者非免疫基因的极大的可再生的对研究疾病的机制有用对药物，毒性测试有用iPS细胞的缺陷：1） 使用c-myc可以用化学代替物如VP
8、A等来代替2） 诱导的低效率可以用单个逆转录病毒或者慢病毒载体来取代四种载体3） 转基因整合可以用不整合的载体4） Are iPSCs as good as ESCs未来的任务：温和的改变所有的基因突变，获得无病的干细胞：用于基因修改的载体：基于人类合成的染色体HAC的载体；腺病毒载体；基于人造细菌BAC的载体最大的问题是缺少导致疾病相关基因的信息。更有效地产生更安全的iPS细胞：降低转录因子的使用数目；特殊通路；更好的载体仍然需要解决的问题：1) iPS细胞是如何致瘤的？2) iPS细胞核干细胞之间的区别？3) 怎样使iPS细胞有最好的临床潜能4) 怎样克服iPS细胞的免疫原性5) 转分化取
9、代？6) 怎样使iPS产生的方法有很大的改良？如何证明IPS全能性：周琪等制备了37株iPS细胞，利用其中6株iPS细胞系注射了1500多个四倍体胚胎，最终3株iPS细胞系获得了共计27个活体小鼠，经多种分子生物学技术鉴定，证实该小鼠确实从iPS细胞发育而成，有些小鼠现已发育成熟并繁殖了后代。这是世界上第一次获得完全由iPS细胞制备的活体小鼠，有力地证明了iPS细胞具有真正的全能性。癌基因：细胞中发生了突变或过度表达并可引起细胞癌变的原癌基因。活化后能引起正常细胞转变为癌细胞的基因。原癌基因proto-oncogene：是细胞内与细胞增殖相关的基因，是维持机体正常生命活动所必须的，在进化上高等
10、保守。当原癌基因的结构或调控区发生变异，基因产物增多或活性增强时，使细胞过度增殖，从而形成肿瘤。抑癌基因：是指能够抑制细胞癌基因活性的一类基因，其功能是抑制细胞周期，阻止细胞数目增多以及促使细胞死亡。通常是一对等位基因均告缺失或都因突变而失去活性时，细胞发生癌变，此时缺失或突变的基因一般就是抑癌基因。p53蛋白结构和功能：P53蛋白为核内转录因子，包括核心区的DNA结合域，N端转录激活域和C端介导寡聚体化的结构域。1、p53的中央域识别和结合一个10bp的启动子序列，可激活转录通过N-端的反式激活域。p53突变大多发生于中央DNA结合域。2、可阻断细胞进入S期，细胞增殖负调控因子，可抑制c-m
11、yc表达及功能3、P53的一个等位基因突变，其产物可抑制另一个野生型产物的作用，通过蛋白-蛋白作用而失活。4、P53突变协助ras基因致癌，P53成为癌基因，这称为显性致癌dominant oncogenic5、正常情况下p53以低水平存在，半衰期短。DNA损伤稳定p53并增加其转录活性Rb基因产物及功能：编码P105-Rb的核蛋白，可与DNA结合，属反式调控因子，其活性受磷酸化有活性/去磷酸化调节，能提供细胞增殖，分化负调控信号，阻止细胞进入S期；阻断c-fos，抑制c-vmyc表达。抑癌基因与原癌基因生物学性质差异：1. 功能：抑癌基因在细胞生长中起负调节作用，抑制增殖、促进分化成熟与衰老
12、，或引导多余细胞进入程序性细胞死亡，原癌基因的作用那么相反。2. 遗传方式：原癌基因是显性的，突变导致非正常激活后即参与促进细胞增殖和癌变过程，而抑癌基因为隐性，只有发生纯合失活时才失去抑癌功能。3. 突变的细胞类型：抑癌基因突变不仅可发生在体细胞中，也可发生在生殖细胞中，并遗传给下一代，而原癌基因只在体细胞中产生突变。恶性肿瘤的发生归根到底是因为原癌基因的突变和抑癌基因的功能丧失，往往涉及多个基因的改变。原癌基因、抑癌基因与细胞癌变的关系:1. 正常条件下，原癌基因和抑癌基因既相互拮抗又相互配合，处于一个动态平衡的状态，共同控制着细胞的增殖活动。2. 原癌基因的激活，或抑癌基因的失活，均能打
13、破二者之间的动态平衡，使细胞增殖失控而发生恶性癌变。核骨架:是细胞核中除去核膜、核孔复合体、核纤层、染色质和核仁之外的一个由纤维蛋白组成的网架结构体系。这一结构体系与DNA复制、基因表达和染色体包装与构建及维持细胞核形态结构等有密切关系。核骨架的功能:1. 为DNA的复制提供支架，结合有DNA复制所需要的酶 。2. 是基因转录加工的场所，有RNA聚合酶的结合位点，RNA的合成在核骨架上进行。3. 与染色体构建有关，一般认为核骨架与染色体骨架为同一类物质，30nm的染色质纤维就是结合在核骨架上，形成放射环状的结构，在分裂期进一步包装成光学显微镜下可见的染色体。核纤层:由核纤肽lamin构成，核纤
14、肽一类中间纤维，分为A 、B 两型。作用：1保持核的形态：2参与染色质和核的组装：核纤层在细胞分裂时呈现出周期性的变化，在间期核中，核纤层提供了染色质异染色质在核周边锚定的位点。在前期结束时，核纤层被磷酸化，核膜解体。其中B型核纤肽与核膜剩余小泡结合，A型溶于胞质中。在分裂末期，核纤肽去磷酸化重新组装，介导了核膜的重建。ECM组成局部类型：胶原、蛋白聚糖、透明质酸、大型糖蛋白、弹性蛋白，Fibrillins, elastin, LTBPs, MAGPs, fibulinsECM组成局部类型概括就是，大多数ECM蛋白是大的、模块化、多区域糖基化的蛋白质。不同区域招募不同ECM蛋白。ECM功能：1
15、，充当结构的支持，维持细胞组织性和完整性；2，划分组织；3，给骨牙齿提供硬度；4，传递信息给临近细胞；5，在发育过程中，充当细胞迁移的高速公路Cell-ECM 粘附包含两种：半桥粒和粘着斑作用：细胞的形态；细胞骨架的组装；细胞的存活；细胞的凋亡；细胞的增殖；细胞的分化；细胞的迁移。细胞外基质对细胞的作用是从粘附、铺展开始的。细胞的铺展由细胞骨架的重新组装所致。细胞外基质对细胞的存活、增殖具有不可或缺的作用。表观遗传学(epigenetic) ：DNA的序列不发生变化、基因表达改变、并且这种改变可就是不基于DNA差异的核酸遗传,即细胞分裂过程中，DNA 序列不变的前提下，全基因组的基因表达调控所决定的表型遗传，涉及染色质重编程、整体的基因表达调控如隔离子，增强子，弱化子，DNA甲基化，组蛋白修饰等功能 )及基因型对表型的决定作用。表观遗传学的特点：没有DNA序列的改变或不能用DNA序列变化来解释；可遗传的，即这类改变通过有丝分裂或减数分裂，能在细胞或个体世代间遗传；可逆性的基因表达调节-基因活性或功能的改变。表观遗传学的研究意义 1.表观遗传学补充了“中心法那么所忽略的两个问题，即哪些因素决定了基因的正常转录和翻译以及核酸并不是存储遗传信息的唯一载体。 2. 表观遗传信
