1、实验论著二甲双胍对 型糖尿病大鼠视网膜的保护及其对血清胱抑素 的调节作用白惠玲，朱晓燕，刘 勤，张延英，康万荣，张 书引用：白惠玲，朱晓燕，刘勤，等 二甲双胍对 型糖尿病大鼠视网膜的保护及其对血清胱抑素 的调节作用 国际眼科杂志；（）：基金项目：甘肃省卫生行业科研计划项目（）；兰州市科技计划项目（）作者单位：（）中国甘肃省兰州市，甘肃省人民医院眼科；（）中国甘肃省兰州市，甘肃中医药大学第一临床医学院；（）中国甘肃省兰州市，甘肃中医药大学科研实验中心作者简介：白惠玲，毕业于兰州大学，硕士，副主任医师，研究方向：角膜病、眼眶病、眼整形、眼免疫。通讯作者：刘勤，毕业于兰州大学，学士，主任医师，研究方
2、向：角膜病、眼视光、眼免疫 收稿日期：修回日期：摘要目的：在大鼠 型糖尿病（）造模的基础上继续制备糖尿病视网膜病变（）模型，观察二甲双胍对 大鼠 的预防及保护作用和对血清胱抑素（）的影响，并对其机制进行探讨。方法：筛选 只雄性 大鼠，随机取 只分为空白对照组（只），组（只）和二甲双胍干预组（只）；其余 只随机分为三组，分别为空白对照组（只），组（只）和二甲双胍干预组（只）。除空白对照组、外，其余所有组大鼠均构建 模型，成模后二甲双胍干预组 大鼠给予二甲双胍灌胃，空白对照组 和 组大鼠均给予生理盐水灌胃，干预 后分别测量三组大鼠的空腹血糖（）和空腹血清胰岛素（）指标，计算并分析胰岛素抵抗指数（）
3、；测各组大鼠血清 、肿瘤坏死因子（）、白细胞介素（）、血管内皮生长因子（）和活性氧（）水平，并行、染色及透射电镜观察大鼠视网膜组织及血管形态；在 病程 后，二甲双胍干预组 大鼠开始给予二甲双胍灌胃，其余大鼠均给予生理盐水灌胃，按干预时长不同，分别于第、各组取 只大鼠进行观察，测各组大鼠血清 、和 水平，并行、染色及透射电镜观察大鼠视网膜组织及血管形态。结果：空白对照组、组和二甲双胍干预组 三组间大鼠血清、和 的表达均有差异（），且均为 组最高，二甲双胍干预组 低于 组；空白对照组、组和二甲双胍干预组 分别在、各同龄组中，三组间大鼠血清 、和 的表达均有差异（），且均为 组最高，二甲双胍干预组
4、的表达低于 组，随着 病程的延长，、和 的表达也进一步增加；结果显示：与对应的空白对照组相比，各模型组大鼠视网膜血管走行迂曲，并且随着病程的延长可见微动脉瘤及荧光渗漏；染色结果显示：与对应的空白对照组相比，各模型组大鼠视网膜细胞排列紊乱，并随着病程的延长可见异常扩张的血管；透射电镜结果显示：与对应的空白对照组相比，各模型组大鼠视网膜毛细血管损伤严重；但与对应模型组比较，各二甲双胍干预组大鼠、和透射电镜结果均有不同程度的改善。结论：二甲双胍可通过下调血清 介导的炎症和氧化应激水平，改善视网膜组织病变，从而对 大鼠视网膜病变起预防和治疗作用。关键词：二甲双胍；型糖尿病；糖尿病视网膜病变；血清胱抑素
5、：，：（）；（），；，；，：，；，：（）（），（），：（），（）（）：（），（）（），（）（），（）；，（），（），（）（），；，：，（），；，（），；，；，；，；，：，：；：，（）；（）：引言糖尿病视网膜病变（，）是糖尿病最常见的眼部并发症，是导致失明的重要原因。炎症反应和氧化应激是贯穿 整个病理过程的关键特征，患者的视力损害主要由该两种途径引起。血清胱抑素（，）是机体有核细胞合成的一种非糖基化碱性蛋白，主要由视网膜色素上皮细胞分泌，近年来有研究表明，血清 是 的独立危险因素之一，因此血清 的分泌情况可能与 的发生和发展密切相关。二甲双胍是目前治疗 型糖尿病（，）的首选口服药物。近期研究表明
6、，二甲双胍还可以通过减轻炎症反应和氧化应激对视网膜色素上皮细胞的损伤，抑制视网膜新生血管生成来延缓 进程。本研究通过观察二甲双胍对 大鼠视网膜血管、组织病理学改变及血清 的影响，旨在探讨二甲双胍通过对血清 调控，预防 大鼠 的发生，同时对已经发生 的大鼠病情转归的干预作用。材料和方法 材料 动物模型的构建及分组给药选取 周龄雄性 大鼠 只，体质量约为，购自甘肃中医药大学动物实验中心许可证号：（甘）。本实验通过甘肃中医药大学实验动物伦理委员会审查（伦理审查编号：）。只大鼠中随机抽取 只分为空白对照组（只），组（只）和二甲双胍干预组（只）；其余 只再次随机分为三组，分别为空白对照组（只），组（只）
7、和二甲双胍干预组（只）。所有大鼠适应性饲养 后给予空白对照组、普通饲料喂养，其余组均给予高脂高糖饲料喂养，饲养 给空白对照组、左下腹腔注射柠檬酸钠缓冲液，将其余组大鼠按 左下腹腔注射链脲佐菌素（），给药后所有大鼠均改为普通饲料喂养，直到实验结束。注药 后测量尾静脉血糖浓度，记录体质量、饮水量和尿量，当血糖，尿糖，且有多饮、多食、多尿时即认为 模型成功。造模成功后给予二甲双胍干预组 大鼠二甲双胍灌胃第 剂量为 （），第 为 （），国际眼科杂志 年 月 第 卷第 期 ：电话：电子信箱：第 调整为 （），该剂量一直保持到，空白对照组 和 组大鼠给予生理盐水灌胃（），每日 次，连续，干预 后三组大鼠进
8、行观察：测量各组大鼠空腹血糖（，）和空腹血清胰岛素（，）指标，计算并分析胰岛素抵抗指数（，），心脏采血测各组大鼠血清、肿 瘤 坏 死 因 子 （，）、白细胞介素（，）、血管内皮生长因子（，）和活性氧（，）水平，并行眼底荧光造影（，）观察各组大鼠眼底血管变化，染色观察各组大鼠视网膜组织形态和厚度，透射电镜观察大鼠视网膜毛细血管 超微形态。在 病程 后，二甲双胍干预组 大鼠开始给予二甲双胍灌胃（），每日 次，连续，空白 对 照 组 和 组 大 鼠 均 给 予 生 理 盐 水 灌 胃（），每日 次，连续。按干预时长不同，分别于第、各组取 只大鼠进行观察：测各组大鼠血清 、和 水平，并行 观察各组大鼠
9、眼底血管变化，染色观察各组大鼠视网膜组织形态和厚度，透射电镜观察大鼠视网膜毛细血管超微形态（图）。试剂与仪器盐酸二甲双胍片：中美上海施贵宝制药有限公司（批号：）；链脲佐菌素：北京索莱宝科技有限公司（批号：）；荧光素钠注射液：美国 （批号：）；眼底血管荧光造影机：德国海德堡公司（型号：）；大鼠胰岛素、试剂盒：江苏菲亚生物科技有限公司；大鼠 试剂盒：上海恒远生物科技有限公司。方法 模型的观察指标 测量空白对照组、组和二甲双胍干预组 大鼠的 和 指标，比较各组的 值、变化并计算分析（）。检查 大鼠腹腔注射 戊巴比妥钠 进行麻醉，双眼滴复方托吡卡胺滴眼液充分散瞳后，将大鼠固定于眼底血管造影机前，腹腔注
10、射 荧光素钠，观察各组大鼠眼底有无病变及荧光素有无渗漏。实验 大鼠经 的戊巴比妥钠 麻醉后行心脏采血，静 置 后 离心，取上清分别检测各组大鼠血清中 、和 含量，并且根据标准曲线和吸光度值计算各组大鼠血清中 、和 的浓度。染色大鼠处死后迅速取出两个眼球，左眼置于眼球固定液行 染色。透射电镜每组大鼠的右眼放入 戊二醛溶液用于透射电镜观察。统计学分析：应用 软件进行统计分析，实验数据正态分布检验后均服从正态分布，采用均值标准差（?）表示。各组间差异比较采用单因素方差分析，两组间比较方差齐选用 检验，不齐选用 检验。为差异有统计学意义。结果 大鼠成模及死亡率 造模大鼠一次成模 只，二次累加成模 只，
11、总成模率。大鼠共死亡 只，死亡率，分别于病程（只）、病程（只）时死亡。空白对照组大鼠无死亡。各组大鼠 和 及 比较三组间、和 差异均具有统计学意义（、，均），见表。与空白对照组 比较，组大鼠、和 显著升高，差异均有统计学意义（），提示 大鼠造模成功；与 组比较，二甲双胍干预组 大鼠、和 显著降低，差异均有统计学意义（）。各组大鼠 检查结果空白对照组 大鼠视网膜血管管径均匀一致，走行规则，以视盘为中心呈放射状分布，未见黄斑样结构（图）；组大鼠眼底可见由稀疏的分支小动脉形成的浅层毛细血管网，毛细血管迂曲并可见荧光渗漏（图）；二甲双胍干预组 大鼠眼底血 管 粗 细 均 匀 一 致，走 行 规 则，未
12、 见 荧 光 渗 漏（图）。提示 病程 时大鼠眼底血管已出现 的改变，而二甲双胍干预可以预防 大鼠眼底血管发生病变。不同干预时间，空白对照组 大鼠眼底血管均清晰可见，管径均匀一致，走行规则，无渗出和出血（图、）。组（组）大鼠眼底血管走行迂曲，可见血管串状样改变和无灌注区形成（图）；组（组）大鼠眼底无灌注区面 积增大，并可见 出血遮蔽荧 光（图）；组（组）大鼠眼底屈光间质混浊，可能存在玻璃体出血（图）。二甲双胍干预组（、组）大鼠眼底屈光间质清晰，荧光渗漏及无灌注区随着二甲双胍干预时间的延长，至 组时眼底病变已明显好转（图、）。各组大鼠血清中 、的浓度各组大鼠血清中 、和 浓度差异均具有统计学意义
13、（、，均）。与空白对照组 相比，组和二甲双胍干预组 大鼠血清中 、和 含量均明显升高，差异均有统计学意义（）；二甲双胍干预组 大鼠血清中、和 含量较 组均明显下降，差异均有统计学意义（），见表。各组大鼠血清中 、和 在、差异均有统计学意义（）。随后用法进行两两比较，结果显示，在各时间点，与同期空白对照组 比较，组和二甲双胍干预组 大鼠血清中、和 含量均明显升高，差异均有统计学意义（），但二甲双胍干预组 大鼠增 ，：图 实验分组及动物处理流程。图 各组大鼠 检查结果：病程；：空白对照组；：组；：二甲双胍干预组；：病程；：空白对照组 组；：组 组；：二甲双胍干预组 组；：病程；：空白对照组 组；：
14、组 组；：二甲双胍干预组 组；：病程；：空白对照组 组；：组 组；：二甲双胍干预组 组。国际眼科杂志 年 月 第 卷第 期 ：电话：电子信箱：表 各组大鼠 和 及 比较?分组（）（）空白对照组 组二甲双胍干预组 注：空白对照组；组。表 各组大鼠血清中 、和 含量的变化?分组（）（）（）（）（）空白对照组 组二甲双胍干预组，注：空白对照组；组。高不如 组明显；与 组比较，二甲双胍干预组 大鼠血清中、和 含量均明显下降，差异均有统计学意义（）。且随着病程的延长，组大鼠血清中 、和 含量也显著增高（均），而二甲双胍干预组 大鼠血清中 、和 含量增高不如 组明显，见表。各组大鼠 染色结果 空白对照组
15、大鼠视网膜各层结构清晰可见，内界膜完整，细胞排列整齐，细胞形态结构正常（图）；组大鼠视网膜各层细胞排列稀疏，细胞间隙明显增宽，内核层和外核层细胞密度明显减少，排列稀疏，厚度变薄（图）；二甲双胍干预组 大鼠视网膜各层结构完整，细胞排列整齐，细胞形态正常（图）。与空白对照组 比较，组大鼠视网膜变薄（）；与 组比较，二甲双胍干预组 大鼠视网膜增厚（，图），提示二甲双胍干预可以预防 视网膜组织发生病变。不同时间点空白对照组（、组）大鼠视网膜各层结构均完整且连接紧密，细胞排列整齐；组（组）大鼠视网膜各层结构排列紊乱，内界膜断裂、水肿，外核层结构明显紊乱、变薄，大量细胞结构被破坏并可见部分空泡，组（组）大
16、鼠视网膜各层结构紊乱加剧，内界膜肿胀断裂严重，可见内皮细胞突破内界膜，神经节细胞层细胞明显减少，组（组）大鼠视网膜内界膜严重肿胀，神经节细胞层细胞进一步减少，内外核层界限消失，内丛状层、内核层、外丛状层、外核层细胞数量均减少，排列稀疏，各层的毛细血管明显扩张，管腔增粗，腔内可见红细胞，还可见部分红细胞渗漏到血管外的组织中，毛细血管数量增加；二甲双胍干预组（、组）大鼠视网膜各层结构排列稍紊乱，少量细胞结构被破坏，形态结构改变较 组各亚组均较轻，见图、。与同期空白对照组比较，组大鼠视网膜变薄（）；与 组比较，二甲双胍干预组 大鼠视网膜增厚（），且随着病程的延长，组大鼠视网膜进一步变薄（），而二甲双胍干预组 大鼠视网膜厚度变化不明显（），见图。各组大鼠视网膜毛细血管的透射电镜结果空白对照组 大鼠视网膜毛细血管由基底膜、内皮细胞和周细胞组成，位于管腔内面的内皮细胞被连续的基底膜和周细胞环绕，内皮细胞和周细胞核形态正常，异染色质分布均匀，细胞器结构清晰，基底膜连续完整（图）；组大鼠内皮细胞和周细胞核的异染色质凝聚靠边，核膜凹陷褶皱，线粒体嵴部分消失，个别呈空泡变，内皮细胞胞质内饮泡增多，胞质向管
