1、2023 年 第 26 卷 第 1 期广西中医药大学学报多穗柯总黄酮的制备及质量控制方法研究袁健童1，2，谷立勍3，柴玲1，2，陈明生1，2，刘布鸣1，2*，陈小刚2，4（1.广西壮族自治区中医药研究院，广西南宁530022；2.广西中药质量标准研究重点实验室，广西南宁530022；3.广西壮族自治区食品药品检验所，广西南宁530021；4.广西壮族自治区民族医药研究院，广西南宁530001）摘要：目的 建立从多穗柯叶中制备总黄酮制品的方法，并建立相应的质量控制方法。方法 采用水浴回流的方法从多穗柯叶粉末中提取总黄酮粗提取物，用大孔树脂对粗提物进行纯化，制成多穗柯总黄酮制品，分别建立薄层色谱法
2、和紫外分光光度法对总黄酮制品进行质量评价。结果 所建立的制备方法从多穗柯叶中制备总黄酮制品得率大于15%，经检测其中含有根皮苷、槲皮素、山柰酚等黄酮类物质，所含黄酮超过60%。结论 所建立的制备方法简单、高效、环保，产品品质高，所建立的定性、定量检测方法能有效反映多穗柯总黄酮制品的质量情况。关键词：多穗柯；总黄酮；大孔树脂；紫外分光光度法；薄层色谱法中图分类号：R284.1文献标识码：A文章编号：2095-4441（2023）01-0045-06引文格式：袁健童，谷立勍，柴玲，等.多穗柯总黄酮的制备及质量控制方法研究 J.广西中医药大学学报，2023，26（1）：45-49，57.收稿日期：2
3、022-06-14基金项目：广西壮族自治区卫生厅中医药科技专项课题（编号：GZKZ 10-006）；广西医疗卫生适宜技术开发与推广应用项目（编号：S201621）*通信作者：刘布鸣（1956），研究员，主要从事中药、天然产物化学成分分析与质量标准研究；E-mail：多穗柯 Lithocarpus polystachyus（Wall.）Rehd.为壳斗科石柯属植物，别名甜茶、甜叶子树、胖稠、甜味茶、大叶稠子、苷茶、多穗石柯等，以野生形式零星分布于我国长江以南各省区的低山密林中。多穗柯是我国传统民间草药，以叶入药，用于治疗湿热痢疾、皮肤瘙痒、高血压和冠心病有较好的疗效1。黄酮化合物在多穗柯中含量高
4、达9.8%，是多穗柯发挥药理保健功能的物质基础2-4。其中，以根皮苷为主的二氢查耳酮类是多穗柯黄酮类化合物的主要成分5，根皮苷在多穗柯中的含量可达 2%5%6-7，作为单体化合物在植物中的含量是非常高的。大孔树脂是一类不溶于酸碱及各种有机溶剂的有机高聚物吸附剂，其选择性好、操作简单、适用范围广，在众多领域广泛应用，特别是在分离纯化中药方面具有较好的效果，用于分离纯化黄酮化合物已有较多报道8-9。本文对多穗柯中总黄酮的提取和纯化工艺进行研究，并以根皮苷作为检测指标建立相应的质量评价方法，为深入研究多穗柯的药用价值提供科学依据。1实验材料1.1药材与试药多穗柯叶片来源于广西巴马，经广西壮族自治区中
5、医药研究院饶伟源主任药师鉴定为壳斗科石柯属植物多穗柯 Lithocarpus polystachyus（Wall.）Rehd.；根皮苷对照品（武汉中标科技有限公司，纯度98%）；槲皮素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100081-201610）；山柰酚对照品（南京狄尔格医药科技有限公司）；甲醇（分析纯）、95%乙醇（分析纯），均购于广东省化学试剂工程技术研究开发中心；大孔树脂（型号：XAD1600N、D101、AB811、XAD16、XAD18、XAD7HP、XAD4，北京慧德易科技有 452023，Vol.26 No.1Journal of Guangxi University of
6、Chinese Medicine限责任公司）；超纯水为实验室自制。1.2仪器UV-2550 紫外分光光度计（日本岛津公司）；电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；XS-205 电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ200B 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HH-S4数显恒温水浴锅（江苏金怡仪器科技有限公司）；旋转蒸发仪 N-1100（上海爱朗仪器有限公司）；油浴锅OSB-2100（上海爱朗仪器有限公司）。2方法与结果2.1多穗柯总黄酮的薄层色谱鉴别2.1.1供试品溶液的制备取多穗柯叶，粉碎过200目筛，称重，置圆底烧瓶中，加入70%乙醇溶液，料液比为1 25，90 下回流
7、30 min，滤过，提取2次，合并滤液，浓缩至无醇味，得多穗柯总黄酮粗提取物。取多穗柯总黄酮加甲醇制成每 1 ml 约含 3 mg 多穗柯总黄酮的供试品溶液。2.1.2对照品溶液的制备取槲皮素对照品适量，加甲醇制成每1 ml含槲皮素约0.05 mg的槲皮素对照品溶液；取山柰酚对照品适量，加甲醇制成每1 ml含山柰酚约 0.06 mg 的山柰酚对照品溶液；取根皮苷对照品适量，加甲醇制成每 1 ml 含根皮苷约 0.6 mg的根皮苷对照品溶液。2.1.3薄层色谱鉴别（1）取上述供试品溶液和槲皮素、山柰酚对照品溶液各5 l，点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-甲酸（10 9 0.5）为展开剂
8、，展开，喷以3%三氯化铝乙醇溶液，在紫外光365 nm下检视。（2）取上述供试品溶液和根皮苷对照品溶液各5 l，点于同一硅胶 G 薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水（7 0.5 0.5）为展开剂，展开，喷以3%三氯化铝乙醇溶液，在紫外光365 nm下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上显相同的荧光斑点。薄层色谱鉴别结果见图1、图2。图1山柰酚、槲皮素薄层鉴别色谱图图2根皮苷薄层鉴别色谱图2.2多穗柯总黄酮的含量测定2.2.1对照品溶液的制备取根皮苷对照品适量，精密称定，用甲醇溶解，制成0.72 mg/ml的对照品溶液。2.2.2供试品溶液的制备取多穗柯总黄酮适量，精密称定，用甲醇溶解，制
9、成1 mg/ml的溶液，作为供试品溶液。2.2.3波长的选择取对照品溶液适量，置于吸收池中，用紫外分光光度计在波长200400 nm下扫描，测定最大吸收波长。结果根皮苷的紫外最大吸收峰为284 nm，根皮苷对照品和供试品溶液紫外吸收光谱图见图3。13多穗柯总黄酮4槲皮素5山柰酚13多穗柯总黄酮4根皮苷图3根皮苷对照品和供试品溶液紫外吸收光谱图a根皮苷对照品光谱图b供试品光谱图2.0952.0001.5001.0000.5000.000-0.147200.00250.00300.00350.00nmnm1.2641.0000.500-0.065200.00250.00300.00350.0040
10、0.00 462023 年 第 26 卷 第 1 期广西中医药大学学报2.2.4线性关系考察精密吸取2.2.1项下对照品溶液2.0 ml、3.0 ml、4.0 ml、5.0 ml、6.0 ml、7.0 ml置于25 ml容量瓶中，分别加入甲醇至刻度，摇匀。在紫外光284 nm下测定吸光度，以根皮苷浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，计算出线性回归方程为Y=0.037 6X+0.025 2，r=0.999 8，表明总黄酮进样浓度在7.228.8 g/ml间与吸光度呈良好线性关系。2.2.5样品测定取供试品溶液适量，置于吸收池中，于284 nm最大吸收波长处扫描吸光度（A），根据线性方程计算
11、供试品溶液中根皮苷的浓度，再计算出总黄酮的含量。2.2.6精密度试验取同一份根皮苷对照品溶液，在紫外分光光度计下连续测量6次，记录吸光度数据，计算相对标准偏差（RSD）值。结果RSD为0.09%（n=6），表明仪器精密度良好。2.2.7稳定性试验取同一份供试品溶液，每间隔2 h测定吸光度1次，共测定7次，观察样品在12 h内的稳定性。结果 RSD 为 1.27%（n=7），表明样品在 12 h内稳定性良好。2.2.8重复性试验取同一批样品 6 份，分别按照2.2.2项下方法制成供试品溶液，测定供试品溶液吸光度，计算每份供试品中总黄酮的含量。结果6份样品平均含量的 RSD 为 1.33%（n=6
12、），表明实验的重复性良好。2.2.9加样回收试验取已知黄酮含量的多穗柯总黄酮提取物样品9份，编号为19号，13号样品中加入约0.5倍黄酮含量的根皮苷对照品，46号样品中加入约1倍黄酮含量的根皮苷对照品，79号样品中加入约1.5倍黄酮含量的根皮苷对照品，再按2.2.2项下方法制成供试品溶液，按 2.2.5 项下方法测定 9份样品中总黄酮的含量，计算回收率和 RSD 值。加样回收试验结果见表 1。9 批样品回收率范围在95%105%之 间，平 均 回 收 率 为 99.68%，RSD 为1.09%（3%），表明方法准确度良好。表1加样回收试验结果（n=9）序号123456789原有量（mg）10.
13、8110.8310.8410.9010.6510.6610.7310.6310.78加入量（mg）5.114.975.2210.3210.149.9715.0315.1215.00实测值（mg）15.6915.7615.9720.9321.0120.3726.2125.6525.69回收率（%）98.5599.7099.4698.64101.0698.72101.7299.6299.64平均回收率（%）99.68RSD（%）1.092.3多穗柯总黄酮提取方法的优化2.3.1提取溶剂的考察取多穗柯叶粉末5份，每份1 g，精密称定，分别加入水、甲醇、乙醇、50%甲醇、50%乙醇各 50 ml，90
14、 加热回流 30 min，滤过，滤液挥干，按2.2.5项下的方法测定总黄酮含量，计算总黄酮得率（mg/g）。结果水、甲醇、乙醇、50%甲醇、50%乙醇的得率分别为 71.9 mg/g、103.8 mg/g、95.3 mg/g、107.8 mg/g、113.5 mg/g，其中 50%乙醇的提取得率最高。2.3.2乙醇不同浓度的考察按2.3.1项下的方法取样6份，分别以30%乙醇、40%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇作为提取溶剂，其它操作同2.3.1项，提取并测定，计算总黄酮得率（mg/g）。结果30%乙醇、40%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇的提取得率
15、分别为 91.3 mg/g、103.4 mg/g、113.5 mg/g、106.5 mg/g、111.7 mg/g、108.4 mg/g，其中70%乙醇的提取得率最高。2.3.3提取温度的考察按 2.3.1项下的方法取样 4份，精密加入70%乙醇溶液各50 ml提取30 min，回流温度分别控制为60、70、80、90，测定每份供试品溶液中总黄酮的含量，计算总黄酮得率（mg/g）。结果 60、70、80、90 下提取得率分别为68.9 mg/g、70.2 mg/g、72.3 mg/g、74.6 mg/g，其中90 下提取得率最高。2.3.4提取时间的考察按 2.3.1项下的方法取样 5份，精密
16、加入70%乙醇溶液各50 ml，90 回流提取，472023，Vol.26 No.1Journal of Guangxi University of Chinese Medicine回流时间分别为30min、60min、90min、120min、150min，测定每份供试品溶液中总黄酮的含量，计算总黄酮得率（mg/g）。结果提取30 min、60 min、90 min、120 min、150min的得率分别为105.7mg/g、105.5mg/g、108.4mg/g、108.9 mg/g、106.0 mg/g。随着提取时间的延长，提取得率并未大幅增加，从节省时间成本考虑，选择以提取30 min为佳。2.3.5提取次数考察按2.3.1项下的方法取样1份，精密加入 70%乙醇溶液 50 ml，称重，90 回流提取30 min，滤过，滤液挥干，按2.2.5项下方法测定总黄酮的含量，滤渣用70%乙醇溶液补足减失重量，再次提取，滤过、挥干并测定，如此反复提取4次，记录每次提取液中总黄酮的含量。提取1、2、3、4次的得率分别为107.6 mg/g、97.7 mg/g、17.3 mg/g、9.2 m
