1、第 卷第 期 河 南 城 建 学 院 学 报 年 月 收稿日期：基金项目：河南省教育厅科技攻关项目（）；河南城建学院大学生创新创业训练计划专项资助（）作者简介：鲁 铁（），男，山东临沂人，博士，讲师，研究方向为大型真菌资源。通信作者：陈艳艳（），女，河南周口人，博士，讲师，研究方向为遗传学。文章编号：（）：伏牛山野生羊肚菌的分子系统学及挥发性成分研究鲁 铁，苏正娴，李 登，段鹏菲，朱园园，张小玉，庄泽伟，张 姝，陈艳艳（河南城建学院 生命科学与工程学院，河南 平顶山；平顶山农业科学院，河南 平顶山）摘 要：以伏牛山地区野生羊肚菌为研究对象，采用传统形态学及分子生物学手段确定物种名称并进行 检测
2、，分析其挥发性成分。结果表明：经传统形态学鉴定，此野生羊肚菌可能为黄色羊肚菌支系，后经分子生物学手段鉴定为粗腿羊肚菌（）；检测鉴定出 种成分，主要包括醇、酮、醛、杂环等类化合物，其中对伏牛山野生羊肚菌风味有重要贡献的是挥发性八碳化合物中的 辛烯 醇和 辛酮，其他挥发性风味成分对羊肚菌风味起调和及辅助呈味作用。关键词：野生羊肚菌；伏牛山；分子系统学；挥发性成分中图分类号：开放科学（资源服务）标识码（）：文献标识码：，（，；，）：，：；羊肚菌属（：）隶属于子囊菌亚门（）、盘菌纲（）、盘菌目（）、羊肚菌科（）。因其菌盖呈褶皱网状、形似羊肚而得名，也被称为羊肚菜、羊肚蘑等。羊肚菌的总氨基酸含量远高于一
3、般食用菌，其中富含多种维生素和多糖。野生羊肚菌最早在 年被人们发现，分布范围较广，遍布世界各地。羊肚菌也因其较高的食药用价值被人工栽培，目前六妹羊肚菌 （）、七妹羊肚菌 （）、梯棱羊肚菌 （）等 个种类已实现了人工化栽培。已有研究发现羊肚菌含有多种特殊氨基酸，如顺 氨基 脯氨酸、氨基异丁酸、，三氨基异丁酸等，可作为调味品和食品添加剂。等检测了野生梯棱羊肚菌新鲜样品的挥发性成分，总计鉴定得到 种芳香化合物和 种未知成分，发现羊肚菌中含有大量的蘑菇醇，这可能是组成羊肚菌的主要香味物质。随着羊肚菌个别种类驯化栽培技术的日趋成熟，羊肚菌种植区域越来越广，而不同的生态条件、种植方式以及品种等都是影响羊肚
4、菌呈味物质的关键因素。对羊肚菌属野生资源进行深入研究，将为更进一步驯化栽培以及开发利用提供基础性育种材料。伏牛山地区是我国南北重要的分界线以及暖温带和亚热带的过渡带，其野生羊肚菌资源丰富，目前该地区羊肚菌产业发展势头强劲，对其野生羊肚菌进行深入性的种源鉴定，将对更进一步的开发利用该地区资源起到积极的助推作用。目前野生羊肚菌挥发性呈味物质研究鲜有报道，本文以伏牛山野生羊肚菌为研究对象，对其进行鉴定及 检测并分析其挥发性成分，以期为伏牛山野生羊肚菌资源的合理保护和开发提供理论依据。材料与方法 材料 供试菌株野生羊肚菌菌株：平顶山市鲁山县林地（，）采集；：洛阳市栾川县天河大峡谷（，）；：洛阳市嵩县白
5、云山（，）；均经组织分离保存于河南城建学院生命科学与工程学院菌种库。试剂与仪器 培养基；真菌 提取试剂盒：北京康润诚业生物科技有限公司；（）、（）：引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；氢氧化钠：烟台市双双化工有限公司；正丁醇、甲醇乙腈：天津市恒兴化学试剂制造有限公司；三氯甲烷：天津博迪化工有限公司；其他试剂均为国产分析纯。气相色谱质谱联用仪：公司；电热恒温鼓风干燥箱：天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司；恒温水浴锅：郑州长城科工贸有限公司；高速离心机：郑州金友宁仪器有限公司；低速离心机：安徽嘉文仪器装备有限公司；仪：美国伯乐；全自动凝胶成像系统：英国 公司。方法 传统形态学鉴定测量菌盖和菌柄
6、大小，并描述颜色、形状和菌盖边缘是否向外延伸，记录横、纵棱纹数量等。切取新鲜菌盖菌褶制作临时装片，以刚果红染液进行染色后在显微镜下对子囊及子囊孢子进行观察及拍照，并测量其大小。野生菌株获取及 提取将野外采集的待定种子实体，采用组织分离法获得纯菌种，具体操作如下：在无菌条件下，选取其子实体部分，用 酒精棉球擦拭消毒后，从菇盖中部纵向撕开，用接种针将菌肉接入 培养基试管中，塞上棉塞，置于 恒温箱中培养 ，组织块的周围长出白色菌丝后，经过转管纯化，即得菌种，备用。提取主要采用改进的 法，经过 扩增 序列，进行克隆测序，所得序列用 河南城建学院学报 年 月软件查看峰图，结果在 中进行 分析比较，参看研
7、究菌种与 中收录的目标物种的同源性是否一致。基因 扩增及凝胶电泳配置 反应体系，见表；反应循环设置，见表。反应结束后，产物于 保存。后使用琼脂糖凝胶电泳法检测，具体操作如下：配置 琼脂糖凝胶 ，放入微波炉加热至琼脂糖融化；当融化的琼脂糖温度降至 时加入 浓缩的 混匀，缓慢倒入制胶板中至凝固；将 电泳缓冲液倒入电泳仪，使其没过凝胶；取 反应液于 电泳 后，利用全自动凝胶成像仪拍照并保存；将未纯化 产物送至苏州金唯智生物科技有限公司测序。表 反应体系组分体积 （）（）表 反应循环设置 反应程序循环数 （）（）（）（）（）（）构建系统发育树通过真菌索引（：）数据库查询鲁山野生羊肚菌的菌种信息以及近缘
8、属种，在 网站中的 查找近似度高的物种信息。选取羊肚菌属共 种大型真菌作为参比序列，将所有的序列汇总于 文本文档中，将其更改后缀为 文件。用 打开格式更改后的文件，并将所有序列进行对齐，手动将两端排列不齐的碱基进行剪切，然后保存为后缀为 格式的文件，再次用 打开，进行建树分析，建树方法选择邻位相连法（）。表 构建系统发育树的 序列信息种名序列号 种名序列号 野生羊肚菌样本预处理活化野生羊肚菌菌株，将其菌丝体收集到 的离心管中，取出 样本，分别加入 蒸馏水，混匀，涡旋，加入 的甲醇乙腈溶液（:，），涡旋，低温超声，次，放置 沉淀蛋白，过滤管过滤后 ，离心 ，取上清冷冻干燥，保存样本，送至上海中科
9、新生命生物科技有限公司进行 分析。检测条件色谱条件：衍生化后样本用不分流模式注入 系统进行分析，进样量为 。样本经 毛细管柱（）分离后进入质谱检测。升温程序：初始温度 ，平衡 ，然后以 的速度升至，并维持。进样口温度，载气为高纯氦气，流速为 ，隔垫吹扫流速 ，溶剂延迟 。第 卷第 期 鲁 铁，等：伏牛山野生羊肚菌的分子系统学及挥发性成分研究质谱条件：采用电子轰击（）离子源，传输线温度 ，离子源温度 ，四极杆温度，电子能量 ；采用全扫描模式（），质量扫描范围 ：，扫描频率为 。数据分析基于上海中科新生命生物科技有限公司数据库和公共数据库代谢物信息对野生羊肚菌挥发性成分进行定性分析。获得不同样品的
10、代谢物数据后，由上海中科新生命生物科技有限公司利用软件 进行质谱定性定量分析，其中包括基线过滤、峰的识别、峰的积分、组分保留时间校正、峰对齐和质谱碎片归属分析等。选择筛选匹配度大于 的物质，通过归一化对获得的数据进行处理，再根据组分的保留时间、质荷比和峰强进行相关注释，并对大部分物质使用标准品进行进一步确认。结果与分析 传统形态学鉴定结果经传统形态学鉴定，野生羊肚菌子实体形态特征如图 ，所示，羊肚菌子实体菌盖呈黄棕色，子实体大小为 ；菌盖稍向外延伸，纵棱纹 条，菌盖中下部不规则分支，横棱纹不规则，数量多。菌柄米白色，。菌柄光滑，在菌盖菌柄交界处有较明显的纵向皱褶。分离获得的菌种如图 所示，菌丝
11、颜色初期白色，生长 后呈现深棕色。子囊及子囊孢子显微特征如图 ，所示，子囊并列生长在子实体菌褶表面，呈指状，内含 个子囊孢子；子囊孢子椭圆形，表面光滑，无色透明，大小为（）（）。初步将该菌株鉴定为黄色羊肚菌支系。图 伏牛山野生羊肚菌形态学特征（：平顶山市鲁山县林地羊肚菌子实体，：洛阳市栾川县天河大峡谷羊肚菌子实体，：洛阳市嵩县白云山羊肚菌子实体，：菌株菌落特征，左（反面），右（正面），：子囊形态，：子囊孢子形态）系统发育分析经对扩增 基因序列进行测序，所测序列在 数据库中进行 比对，结果显示伏牛山野生羊肚菌序列均与羊肚菌属（）中粗腿羊肚菌（）的 基因序列高度一致，且最大一致性高达 ，表明可能为
12、粗腿羊肚菌。圆锥钟菌与羊肚菌为同科不同属，且近缘关系较近，故选取圆锥钟菌 作为外类群，选取羊肚菌属共 种真菌作为参比序列，采用邻位相连法（）构建系统进化树，结果见图。由图 可知：伏牛山羊肚菌菌株均与粗腿羊肚菌（）聚为一支，支持率为，差异较小；与比对结果一致。挥发性成分检测结果分析 检测后，根据鲁山野生羊肚菌挥发性组分的保留时间、号、匹配度、相对含量，进行鲁山野生羊肚菌挥发性物质分析，依据 号进行查询并以公共数据库为背景，从鲁山野生羊肚菌中确 河南城建学院学报 年 月定出 种物质，包括 种醛类、种醇类、种烃类、种酮类、种含硫类和 种杂环类物质，获得谱图见图。色谱分离后，质谱裂解得到每个色谱峰的质
13、谱图。通过峰面积归一法计算出各化合物峰面积的相对含量，结果见表。图 待定种 序列使用 法构建的系统进化树图 鲁山野生羊肚菌挥发性组分流图其中，只有一小部分对其整体风味有重要贡献，还有一些成分对整体风味起辅助作用，这些化合物共同形成伏牛山羊肚菌的特有香气。有研究 表明，挥发性八碳化合物（）是食用菌最重要的风味化合物，主要包括 辛醇、辛烯 醇、辛烯 醇、辛烯 醇、辛烯 酮、辛酮等，它们均是由亚油酸经脂肪氧化酶催化形成，具有浓郁的蘑菇风味，尤其是 辛烯 醇（即“蘑菇醇”），普遍存在于食用菌中，且含量丰富。其次参考李润、殷朝敏等人 的文献发现：含硫化合物作为食用菌的另一个主要挥发性风味物质，是通过谷氨
14、酰转肽酶和 半胱氨酸亚砜裂 第 卷第 期 鲁 铁，等：伏牛山野生羊肚菌的分子系统学及挥发性成分研究解酶催化含硫化合物前体物质香菇酸产生的；食用菌中的 辛烯醛和癸烷也是主要呈味物质，文献 所提到的物质在本次伏牛山野生羊肚菌的 结果中均被检测出来。表 鲁山野生羊肚菌挥发组分中可鉴别的化学成分种类编号中文名结构式分子式保留时间 匹配度 相对含量 异戊醛 己醛 己醛 亚甲基己醛（，），壬二烯醛 醛类正辛醛 乙基己烯醛 反 辛烯醛 癸醛 苯甲醛（）壬烯醛，二甲基苯甲醛 乙醇 异戊醇 正己醇 醇类 甲基 庚醇 辛烯 醇 异辛醇 芳樟醇癸烷 己腈烃类间二甲苯，四甲基苯 苯甲腈；氰化苯 十六烷基环八硅氧烷 河
15、南城建学院学报 年 月续表 种类编号中文名结构式分子式保留时间 匹配度 相对含量 庚酮 辛酮 仲辛酮 甲基庚烯酮 酮类 壬酮 丙酮基环戊酮 辛烯 酮苯乙酮 香叶基丙酮 含硫类二甲基二硫 杂环类 戊基呋喃 结果与讨论经传统形态学鉴定，该野生羊肚菌菌株可能为黄色羊肚菌系，由系统发育树结果可得，待定种与粗腿羊肚菌 最为接近，二者分支较短，说明亲缘关系很近，且自展值高达 ，待定种很有可能为粗腿羊肚菌。通过 分析表明，辛烯 醇和 辛酮是其产生独特香味的主要物质，而其余挥发性八碳化合物（）未被检测出，可能是由于该类化合物稳定性低，萃取过程造成的破坏大，使得这类化合物未被检出。此外，以 辛烯醛、癸烷和二甲基
16、二硫为主的其余含硫化合物、醛类、酮类及其他挥发性风味成分对食用菌风味起调和及辅助呈味作用，挥发性化合物的综合作用，构成了伏牛山野生羊肚菌特有香气。参考文献 王震，王春弘，蔡英丽 等 羊肚菌人工栽培技术 中国食用菌，（）：杜习慧，赵琪，杨祝良 羊肚菌的多样性、演化历史及栽培研究进展 菌物学报，（）：赵曜，张强 羊肚菌的营养成分和药理作用研究进展 中国林副特产，（）：，（），（）：黄年来，林志彬，陈国良 中国食药用菌学 上海：上海科学技术文献出版社，（），（）：刘蓓，吴素蕊，朱萍，等 滇西北地区四种羊肚菌营养成分分析 食品工业科技，（）：第 卷第 期 鲁 铁，等：伏牛山野生羊肚菌的分子系统学及挥发性成分研究 卢可可，谭玉荣，吴素蕊，等 不同产地尖顶羊肚菌多酚组成及抗氧化活性研究 食品科学，（）：李小林，陈诚，黄羽佳，等 顶空固相微萃取 气质联用分析 种野生食用菌干品的挥发性香气成分 食品与发酵工业，（）：李小林，陈诚，清源，等 会东县不同品种块菌挥发性香气成分的 分析 食品科学，（）：方三平，蒲彪，陈安均，等 成熟度对印度块菌香气成分的影响 菌物学报，（）：张世奇，阚建全 会东块菌香气成分
