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沸石咪唑框架纳米复合颗粒对菌膜的清除研究_侯嘉欣.pdf

上传人:哎呦****中 文档编号:421519 上传时间:2023-03-29 格式:PDF 页数:7 大小:1.78MB
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资源描述

1、第52卷 第1期2 0 2 3年 2月Vol.52,No.1Feb.,2 0 2 3上海师范大学学报(自然科学版)Journal of Shanghai Normal University(Natural Sciences)沸石咪唑框架纳米复合颗粒对菌膜的清除研究侯嘉欣,彭龙漩,杨得民,吕敏*(上海师范大学 化学与材料科学学院,上海200234)摘 要:近年来,新型纳米抗菌材料因其特殊的理化性质和作用机制,在抗菌膜方面展示了不容忽视的潜力.但是,如何提高这些抗菌剂穿透菌膜胞外聚合物基质(EPS)的能力,以达到低剂量、高疗效的目的,仍是一个挑战.为了解决这个难题,通过一锅法成功合成了一种带正电、

2、靶向菌膜中胞外脱氧核糖核酸(eDNA)的沸石咪唑框架纳米复合颗粒(ZIF-8D).研究发现,ZIF-8D能够迅速穿透菌膜,并在菌膜内部释放脱氧核糖核酸酶I(DNase I),DNase I能水解菌膜中的eDNA,以达到分散菌膜的目的.这项研究不仅为设计高穿透性的抗菌膜材料提供了新思路,而且拓展了沸石咪唑框架结构在生物医学领域的应用.关键词:细菌耐药性;沸石咪唑框架;铜绿假单胞菌;菌膜中图分类号:Q 939 文献标志码:A 文章编号:1000-5137(2023)01-0053-07Study on zeolitic imidazolate framework nanocomposites fo

3、r biofilm eradicationHOU Jiaxin,PENG Longxuan,YANG Demin,LYU Min*(College of Chemistry and Materials Science,Shanghai Normal University,Shanghai 200234,China)Abstract:In recent years,novel antibacterial nanomaterials show a non-negligible potential in anti-biofilm due to their specific physiochemica

4、l properties and mechanism of action.However,it is still a challenge to improve the ability of these antibacterial agents to penetrate the extracellular polymeric matrix(EPS)of the biofilm to achieve the goal of high efficacy at low dose.To solve this problem,we adopted the one-pot method to success

5、fully synthesize a zeolitic imidazolate framework nanocomposite with positive charge and targeting extracellular deoxyribonucleic acid(eDNA)in the biofilm(ZIF-8D).The results showed that ZIF-8D nanoparticles could quickly penetrate the biofilm and release deoxyribonuclease(DNase I)inside the biofilm

6、,which hydrolyzed the eDNA to disperse the biofilm.This work not only provides a new insight into designing anti-biofilm materials with high penetrability,and also expands the application of zeolite imidazole frameworks in biomedicine.Key words:antimicrobial resistance;zeolitic imidazolate framework

7、;Pseudomonas aeruginosa;biofilmDOI:10.3969/J.ISSN.1000-5137.2023.01.008收稿日期:2022-07-15基金项目:国家自然科学基金(31971310)作者简介:侯嘉欣(1998),女,硕士研究生,主要从事抗菌纳米材料的构建和应用方面的研究.E-mail:*通信作者:吕 敏(1984),女,副研究员,主要从事抗菌纳米材料与微生物群体感应方面的研究.E-mail:引用格式:侯嘉欣,彭龙漩,杨得民,等.沸石咪唑框架纳米复合颗粒对菌膜的清除研究 J.上海师范大学学报(自然科学版),2023,52(1):5359.Citation fo

8、rmat:HOU J X,PENG L X,YANG D M,et al.Study on zeolitic imidazolate framework nanocomposites for biofilm eradication J.Journal of Shanghai Normal University(Natural Sciences),2023,52(1):5359.2023年上海师范大学学报(自然科学版)J.Shanghai Normal Univ.(Nat.Sci.)0 前 言 专家预测到2050年,全球每年将有1 000万人死于细菌耐药性.除了抗生素滥用导致细菌产生耐药基因外,

9、细菌自身形成群体结构菌膜(biofilm)也是诱发细菌耐药性的重要因素1-2.研究表明,60%70%的细菌感染与菌膜的形成有关,而菌膜诱发的细菌耐药性与其自身结构密切相关3-4.菌膜是一种有别于浮游细菌的生存方式,它是细菌为适应生存环境而吸附于材料表面,形成由细菌及其自身分泌的胞外聚合物基质(EPS)组成的群体结构5.EPS是由胞外脱氧核糖核酸(eDNA)、结构蛋白、胞外多糖和脂质等生物大分子通过缠结、静电吸附等方式形成的类水凝胶结构6.eDNA在细菌的黏附和菌膜的形成中起关键作用,成为当前菌膜清除的重要靶点7.大量报道证实,菌膜结构可以有效阻碍环境不利因素(例如抗生素、机械力和渗透压等)对其

10、内部细菌的直接伤害.临床处理菌膜细菌所需的抗生素剂量是处理浮游细菌的101 000倍8-10.因此,如何提高抗菌剂穿透菌膜EPS结构的能力,精准靶向菌膜结构组分,实现高效解决细菌菌膜感染,成为生物医学和材料学交叉研究领域的前沿热点.近年来,金属有机框架材料(MOF)因其可控的粒径、高比表面积、可调的孔径和良好的生物相容性,在药物递送、生物成像和疾病治疗等方面表现出极大的应用前景11-14.沸石咪唑框架(ZIF-8)因具有多孔、高负载、低毒性,以及对pH敏感等特点,常作为药物和生物大分子(蛋白质、DNA和酶等)的载体 15,用于肿瘤和细菌感染等疾病的治疗.例如,BAGCHI等 16 利用药物方酸

11、(SQ)修饰的金属有机框架ZIF-8,增强光动力(PDT)对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和菌膜的疗效;SU等17开发了一种内置伏立康唑的沸石咪唑框架(V-ZIF),锌离子(Zn2+)与伏立康唑的配位结合可减少伏立康唑的意外泄漏,实现了伏立康唑的零级释放动力学,有助于穿透白色念珠菌菌膜,并杀死念珠菌.目前,ZIF-8在抗菌膜方面的应用主要聚焦于运载抗生素进入菌膜,通过杀死细菌破坏菌膜.然而,精准靶向菌膜结构组分,通过物理或化学方法破坏生物大分子间的相互作用以实现菌膜清除的报道还较为少见.因此,本研究选择革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PAO1)为模

12、式生物构建菌膜,以菌膜中的eDNA为靶点构建新型抗菌膜策略.铜绿假单胞菌是一种常见的条件致病菌,可感染人体的任何组织和部位,引起手术切口和烧伤组织感染、中耳炎18、角膜炎19、尿道炎20、肺炎21和心内膜炎22-23等疾病,常被用于实验室研究菌膜行为的模式生物.本研究设计了一种新型抗菌膜材料,即用ZIF-8纳米颗粒吸附脱氧核糖核酸酶I(DNase I)形成沸石咪唑框架纳米复合颗粒ZIF-8D.该材料与菌膜间存在静电作用,能够增强材料在菌膜中的穿透性,菌膜内部酸性环境可以刺激ZIF-8降解,释放DNase I和Zn2+.DNase I能水解eDNA以破坏菌膜结构和实现Zn2+抗菌,实现高效清除菌

13、膜的目的.本研究为深入了解菌膜与抗菌剂之间的相互作用提供了理论指导,也为治疗临床中的菌膜感染提供了新策略.1 材材料与方法 1.1实验材料DNase I(脱氧核糖核酸酶I来源于牛胰腺)、结晶紫(CV)购于Sigma-Aldrich公司;2-甲基咪唑、硝酸锌六水合物(Zn(NO3)2 6H2O)购于上海国药集团化学试剂有限公司;荧光染料Alexa flour 647,SYTO 9购于Invitrogen公司;LB肉汤培养基、Agar琼脂粉购于生工生物工程(上海)股份有限公司;铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)购于中国普通微生物菌种保藏管理中心;超纯水用Aquapro系统

14、(电阻率为18 M cm)制备.1.2实验仪器场发射扫描电子显微镜(FE-SEM,Hitachi S-4800);动态光散射(DLS)分析仪(Malvern Nano-ZS90);紫外分光光度仪(Shimadzu UV-1800);荧光分光光度仪(Hitachi F-7000);酶标仪(Thermo Multiskan MK3);激光共聚焦显微镜(Leica TCS SP8);pH计(MSC-100);离心机(Eppendorf Centrifuge 5424 R);超声机(XM300UHP);生化培养箱(LRH-70F);X射线衍射仪(XRD,BRUKER/AXS,D8 ADVANCE);恒

15、温振荡器(THZ-C-L).54第1期侯嘉欣,彭龙漩,杨得民,等:沸石咪唑框架纳米复合颗粒对菌膜的清除研究1.3实验方法1.3.1ZIF-8D的合成2-甲基咪唑(0.28 g)充分溶解于1 mL水中,Zn(NO3)2 6H2O(0.015 g)充分溶解于100 L水中;两者充分混匀后,室温(25)静置2 h;再向上述混合溶液中加入100 L DNase I溶液(1.2 mg mL-1),充分混匀后室温(25)静置2 h;10 000 r min-1离心10 min得到ZIF-8D.1.3.2ZIF-8D的表征FE-SEM表征ZIF-8和ZIF-8D的形貌和粒径大小.DLS表征ZIF-8和ZIF

16、-8D的Zeta电位;在8 d内测定ZIF-8D水合粒径,确定材料的稳定性.XRD表征ZIF-8和ZIF-8D的晶体结构.1.4细菌培养从4 保存的细菌平板挑取单菌落接种于3 mL LB液体培养基中,37 摇床(220 r min-1)振荡培养过夜.收集菌悬液,10 000 r min-1离心菌液1 min,去除上清液,并用生理盐水(NaCl,质量分数为0.9%)重悬沉淀,用紫外分光光度计测定菌液在600 nm处的光密度值(OD600),稀释菌液浓度至109 CFU mL-1备用.1.5ZIF-8D抗菌膜性能测定1.5.1菌膜生长24孔板中加入浓度为107 CFU mL-1细菌悬液,37 静态生长24 h.培养结束后,轻轻吸去上部菌液,并用1 mL磷酸盐缓冲液(PBS)轻轻清洗孔板底部的菌膜.然后,每孔加入200 L的不同材料(DNase I,ZIF-8和ZIF-8D),37 共同孵育2 h.1.5.2CV染色菌膜与ZIF-8D共孵育2 h后,吸去上清液,用1 mL PBS轻轻冲洗菌膜1次并风干.然后加入300 L质量分数为0.1%的CV染色,染色15 min,吸去上清,PBS轻轻洗涤

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