1、收稿日期:2022 09 06;修订日期:2022 12 13作者简介:刘珍妮(1994)，女，畜牧师，从事动物营养与动物疫病研究。基金项目:2022 年赣州市赣南科学院科技计划专项(赣市科院字 2022 20 号);2019 年赣州市科技计划项目(赣市科发 2019 27 号);江西省家禽产业技术体系(JXAS 09);2021 年赣州市科技计划项目(赣市科发 2021 24 号)。*通信作者:雷小文(1983)，男，硕士，副研究员。E mail:343224896 qq com。第 41 卷第 1 期2023 年 2 月江西科学JIANGXISCIENCEVol 41 No 1Feb 20
2、23doi:1013990/j issn1001 3679 202301008番鸭 HSP70 的 SYB Green I 实时荧光定量PC 检测方法的建立及其初步应用刘珍妮1，陈强2，钟尧禹2，雷小文1*，吴辉生3，胡汝琴3，邱静芸1，史湖敏1，钟云平1(1 赣州市畜牧水产研究所，341401，江西，赣州;2 赣州市南康区农业技术推广中心，341400，江西，赣州;3 赣州职业技术学院，341099，江西，赣州)摘要:旨在建立一种高灵敏度的番鸭热休克蛋白 70(Heat shock 70，HSP 70)基因的荧光定量 PC 检测技术，并以此技术检测番鸭在热应激前后 HSP70 基因转录表达量
3、的变化情况。由 NCBI 上 HSP 70 基因保守序列来设计特异性引物，将试验番鸭的 mNA 反转为 cDNA，检验其重复性、特异性和灵敏度，利用建立的方法对热应激条件下番鸭体内各组织基因的转录变化进行检测。结果表明:本研究构建的 SYB Green I 实时荧光定量 PC 检测方法所用的引物特异性较好，与 1 35 1021 35 107copies/L 的 PC 产物之间存在着良好线性关系，方程为 y=1 96 x+18 2，相关系数为 0 983，扩增效率为 226 55%;熔解温度 Tm值为(84 01 0)，曲线呈特异性单一峰;该方法的灵敏度为 1 35 102copies/L。与
4、正常条件相比，热应激条件下番鸭血液、心脏、肝脏、脾脏、肾脏和肌肉的 HSP 70 基因表达水平显著升高(P 0 05)。该研究成功构建了番鸭 HSP 70 基因荧光定量 PC 检测新技术，并对长期热应激条件下，番鸭体内 HSP 70 基因的转录水平进行了深入研究，为后续试验的开展提供了重要的数据基础和技术条件。关键词:番鸭;热休克蛋白 70;实时荧光定量 PC中图分类号:S834文献标识码:A文章编号:1001 3679(2023)01 039 06Establishment and Preliminary Application of SYB Green Ieal Time PC Assay
5、 for Detection of HSP 70 in Muscovy DuckLIU Zhenni1，CHEN Qiang2，ZHONG Yaoyu2，LEI Xiaowen1*WU Huisheng3，HU uqin3，QIU Jingyun1，SHI Humin1，ZHONG Yunping1(1 Ganzhou Animal Husbandry esearch Institute，Gannan Academy of Sciences，341401，Ganzhou，Jiangxi，PC;2 Nankang District Agricultural Technology Extensio
6、n Center，341400，Ganzhou，Jiangxi，PC;3 Ganzhou Vocational and Technical College，341099，Ganzhou，Jiangxi，PC)Abstract:The aims of this study are to establish a highly sensitive fluorescence quantitative PC as-say for the detection of Heat shock 70(HSP70)gene in Muscovy ducks，and to detect the changesof t
7、ranscriptional expression of HSP70 gene in Muscovy ducks after heat stress Specific primerswere designed based on the conserved sequence of HSP 70 gene in NCBI，and the mNA samples ofblood were reversely transcribed into cDNA Then，the repeatability，specificity and sensitivity ofthe mNA samples were t
8、ested The established method was used to detect the transcription changesof genes in various tissues of Muscovy ducks under heat stress The results showed that:The primersused in the SYB Green I fluorescence quantitative PC established in this study had good specifici-ty，and there was a good linear
9、relationship between them and the PC products of 135 102135107copies/L The equation was y=1 96 x+18 2，and the correlation coefficient was0 983 The amplification efficiency was 22655%The Tmvalue of melting temperature was(8401 0)，and the curve showed a specific unimodal pattern The sensitivity of thi
10、s method was1 35 102copies/L Compared with the normal condition，the expression of HSP 70 gene inblood，heart，liver，spleen，kidney and muscle of muscovy ducks under heat stress condition wassignificantly increased(P 0 05)In this study，a new fluorescence quantitative PC assay for thedetection of HSP 70
11、gene of Muscovy duck was successfully constructed，and the transcription levelof the HSP 70 gene in Muscovy ducks under long term heat stress was studied in depth，which pro-vided important data basis and technical conditions for subsequent experimental studiesKey words:muscovy duck;HSP70;fluorescence
12、 quantitative PC0引言动物的应激反应主要是指机体对各种内外界刺激因素引起的适应性的非特异性反应1。而热应激指的是畜禽对高温高湿这一非常规刺激所产生的生理反应2。热休克蛋白(heat shock pro-tein，HSP)又叫做热激蛋白，是指蛋白质在热应激环境下结合起来的有保存蛋白质作用的蛋白质家族，除去高温高热外，饥饿、微生物感染、紫外线、缺血、重金属、低氧含量等多种应激原也可以导致热休克蛋白表达水平的上升3。研究发现，热休克蛋白也是先天和适应性免疫系统的免疫刺激“危险信号”4。据报道，作为主要的热休克蛋白，热休克蛋白 70(heat shock protein 70，HSP7
13、0)正常条件下的表达水平较低，当机体受到冷热、过氧化等刺激时，其表达水平便会明显提高5。功能和表达调控是目前 HSP70 的主要研究重点，而转录和翻译则主要是 HSP70 表达调控的主要研究方向6。现有技术还未能够对番鸭应激进行有效、快速、准确地检测，基于此，建立一种简便、快捷、准确的 HSP70 的 mNA 定量方法，并将其应用于应激诊断是十分必要的。作为近几年来快速兴起的一种定性、定量检测技术，实时荧光定量 PC(fluorescence quantita-tive PC，FQ PC)方法简便快速、易于标准化、特异性好、灵敏度强，在基因表达研究分析等领域有着广阔的应用前景7。本次试验通过构
14、建HSP 70 荧光定量 PC 的定量测定方法，并将其初步应用于正常温度条件下和热应激条件下，番鸭体内血液和各组织脏器(心脏、肝脏、脾脏、肾脏和肌肉)内 HSP 70 表达水平的检测，以期为番鸭在热应激方面的检测和诊断提供一定的方案。1材料与方法1 1试验动物及试剂试验番鸭购于江西赣州;柱式动物组织总NA 抽提纯化试剂盒、DNA 分子量标准 Marker A(100 2 000 bp)、4S Green Plus 无毒核酸染料、5 甘油凝胶上样缓冲液(含二甲苯青、溴酚蓝)、焦碳酸二乙酯购于生工生物工程(中国上海)股份有限公司;反转录试剂盒、PC Mix 和 Perfect-StartTMGre
15、en qPC SuperMix 试剂盒购于全式金生物技术有限公司(中国北京)。1 2材料与方法1 2 1总 NA 的提取和引物的设计按照柱式动物组织总 NA 抽提纯化试剂盒说明书提取样品组织中的全部 NA。通过 Primer Premier 5 0软件设计 2 对引物，如表 1 所示。表 1荧光定量 PC 引物基因引物序列登录号扩增产物长度GAPDHF:5 TGCTAAGCGTGTCATCATCT 3:5 AGTGGTCATAAGACCCTCCA 3AY436595(Genebank)187 bpHSP 70F:5 TAGTCACAAAGCCAAAACCC 3:5 CCCACTGTTGCCAT
16、CCC 3NM_001310775(NCBI)101 bp04江西科学2023 年第 41 卷1 2 2cDNA 的合成及 HSP 70 序列的扩增利用 1 2 1 中提取的总 NA 为模板进行反转录生成 cDNA，反转录条件为:42 反转录15 min，85 作用 5 s。随后，选择已合成的 cDNA 为模板，以设计的 HSP 70 F 和 HSP 70 为引物，扩增番鸭的目的基因 HSP 70，具体的扩增反应条件如下所示:94 预变性 2 min，94 30 s，58 30 s，72 15 s;循环 35 次后，在 72 的条件下延伸10 min。同时设置一等量Nase Free ddH2O 代替模板的阴性对照，以设计的 HSP 70 F 和 HSP 70 引物、GAPDH F 和 GAPDH 进行 PC 扩增。1 2 3FQ PC为了使获得的荧光 Ct 值最小、熔解曲线为单峰且荧光阈值最高，纯化回收1 2 2 扩增的 PC 产物，以此为模板，使用荧光定量引物在 LineGene 9600 Plus 荧光定量聚合酶链反应检测系统上进行扩增及分析。FQ PC 按照 PerfectSt
