1、干扰 FAM201A 通过调控 mi-146a-5p/GATA6 影响直肠癌细胞生物学行为张丽1董巧云1宋荣2侯丽1陶菊花3(1 巴彦淖尔市医院消化内科，内蒙古巴彦淖尔015000;2 巴彦淖尔市临河区人民医院;3 巴彦淖尔市医院肿瘤中心)摘要 目的探讨长链非编码 NA(lncNA)FAM201A 对直肠癌细胞生物学行为的影响及其分子机制。方法选取 23 例直肠癌患者的癌组织及癌旁组织，用实时荧光定量 PC(qT-PC)检测序列相似性 201 家族成员(FAM201)A、mi-146a-5p 和人 GATA 结合蛋白(GATA)6 mNA 的表达水平;将直肠癌细胞 SW837 分为 si-NC
2、 组、si-FAM201A 组、mi-NC 组、mi-146a-5p 组、si-FAM201A+anti-mi-NC 组、si-FAM201A+anti-mi-146a-5p 组;克隆形成实验检测集落形成数;流式细胞术检测细胞凋亡;Western 印迹法检测 GATA6 蛋白的表达;双荧光素酶报告实验检测 FAM201A 与 mi-146a-5p，mi-146a-5p 与GATA6 的靶向关系。结果直肠癌组织中 FAM201A 和 GATA6 mNA 表达水平升高，mi-146a-5p 表达水平降低，差异有统计学意义(P0.05)。干扰 FAM201A 或过表达 mi-146a-5p，直肠癌细
3、胞的集落形成数减少，细胞的凋亡率升高，差异有统计学意义(P0.05);经 4 Gy 射线照射后，集落形成数减少，凋亡率升高，且细胞存活分数降低(P0.05)。抑制 mi-146a-5p 可逆转干扰 FAM201A 对直肠癌细胞集落形成及凋亡的影响。FAM201A 靶向调控 mi-146a-5p;mi-146a-5p 靶向调控 GATA6。结论干扰 FAM201A 通过调控 mi-146a-5p/GATA6 抑制直肠癌细胞集落形成，促进细胞凋亡，增强其放射敏感性。关键词 FAM201A;mi-146a-5p;人 GATA 结合蛋白(GATA)6;直肠癌;放射敏感性;凋亡中图分类号 735.3 文
4、献标识码 A 文章编号 1005-9202(2023)03-0694-06;doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2023.03.047通信作者:董巧云(1972-)，女，主任医师，主要从事消化道肿瘤研究。第一作者:张丽(1986-)，女，副主任医师，主要从事消化道肿瘤研究。直肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，放射治疗是局部晚期直肠癌治疗的方式之一，联合手术治疗可降低局部复发率，提高患者总生存率1，2;然而放射抵抗性的出现降低了放疗效果，提高癌细胞的放射敏感性是提高其治疗效果的重要途径和方法。研究发现长链非编码 NA(lncNA)可通过调节各种机制影响放射敏感性，有望在将来
5、成为放射治疗的潜在治疗靶标3。序列相似性201 家族成员(FAM201)A 是一种新型的 lncNA，研究报道抑制FAM201A 可在体外抑制肺鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并在体内抑制肿瘤的生长4。FAM201A 在放射抵抗的非小细胞肺癌患者组织中显著上调，与患者放射抵抗和生存期降低密切相关;沉默 FAM201A在体外和体内均可在 X 射线照射下抑制非小细胞肺癌细胞的增殖和诱导细胞凋亡5。抑制 lncNAFAM201A 通过靶向 mi-488-3p 可抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭，促进胃癌细胞凋亡，并增加其放射敏感性6。然而 FAM201A 对直肠癌细胞增殖、凋亡和放射敏感性的影响尚不清楚。m
6、i-146a-5p 是 mi-146a 家族中主要成员之一，研究报道 mi-146a-5p 在结直肠癌中失调表达，可作为检测结直肠癌的非侵入性生物标志物7。mi-146a-5p 可通过影响结直肠癌细胞的细胞周期进程而发挥抑癌作用8。mi-146a-5p 可以通过激活 DNA 修复途径和抑制复制蛋白(P)A3 来抑制肝癌细胞的增殖，并促进放射敏感性和凋亡9。表明 mi-146a-5p 可抑制结直肠癌进展，还可影响肿瘤放射敏感性。本实验通过在线软件预测发现mi-146a-5p 和人 GATA 结合蛋白(GATA)6 有结合位点;GATA6 基因位于染色体 18q11.1 q11.2 上，在多种肿瘤
7、中作为促癌基因10。GATA6 蛋白在结肠癌组织中表达量增加，与患者预后有关11。mi-455 过表达通过靶向 GATA6 抑制结直肠癌细胞的增殖和侵袭12。抑制 GATA6 显著增加了辐射诱导的结肠癌细胞 HT55 和 HT29 凋亡13。然而 mi-146a-5p 是否通过调控 GATA6 影响直肠癌进展及放射敏感性尚不清楚，且 FAM201A 对直肠癌细胞增殖、凋亡和放射敏感性的影响是否与 mi-146a-5p和 GATA6 有关也不清楚。因此，本实验旨在研究FAM201A 对直肠癌细胞增殖、凋亡和放射敏感性的影响及其机制是否与 mi-146a-5p 和 GATA6 有关。1材料与方法1
8、.1临床组织来源选取内蒙古巴彦淖贝尔市医院外科手术切除的 23 例直肠癌患者癌组织及癌旁正常黏膜组织，男 13 例、女 10 例，年龄 40 61 岁，平均(47.633.47)岁;病程 1 3 年，平均(1.02496中国老年学杂志 2023 年 2 月第 43 卷0.54)年，分期 1 期8 例，2 期10 例，3 期5 例。所有患者手术前未进行过放化疗，患者均知情且同意。1.2材料直肠癌细胞 SW837 购自美国 ATCC;PMI1640 培养基购自美国 Gibco 公司;Trizol 试剂购自美国 invitrogen 公司;荧光定量试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司;凋亡检测试剂
9、盒购自美国 Biovision 公司;蛋白提取试剂盒购自亚科因(武汉)生物技术有限公司;双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国 AAT Bioquest 公司。1.3细胞处理与分组直肠癌细胞 SW837 用 P-MI1640 培养基常规培养，将 si-NC、si-FAM201A、mi-NC、mi-146a-5p 转染至 SW837 细胞中，记为 si-NC组、si-FAM201A 组、mi-NC 组、mi-146a-5p 组;将 si-FAM201A 分别与 anti-mi-NC、anti-mi-146a-5p 共转染至 SW837 细胞中，记为 si-FAM201A+anti-mi-NC组、s
10、i-FAM201A+anti-mi-146a-5p 组。1.4实时荧光定量 PC(T-qPC)检测 FAM201A、mi-146a-5p 和 GATA6 mNA 的表达水平提取直肠癌组织、癌旁组织及细胞的总 NA，合成 cDNA后按荧光定量试剂盒说明进行 PC，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和 U6 为内参，用 2Ct法计算相对表达量。FAM201A 上游引物:5-CCAGGCTCTTT-GATCACCAT-3，下游:5-GAGTTTCCTGGGATGTG-GAA-3;mi-146a-5p 上 游 引 物:5-TGAGAACT-GAATTCCATGGGTT-3，下 游:5-CCCA T
11、GGAAT-TCAGTTCTCATT-3;GATA6 上游引物:5-CTCAGT-TCCTACGCTTCGCAT-3，下游:5-GTCGAGGTCAGT-GAACAGCA-3;GAPDH 上游引物:5-TCA CCATCT-TCCAGGAGCG-3，下游:5-CTGCTTCACCACCTTCT-TGA-3;U6 上游引物:5-CAAGGATGACACGCAAA-3，下游:5-TCAACTGGTGTCGTG-3;引物由上海生工生物工程公司合成。1.5克隆形成实验将 1.3 中各组细胞以适宜密度接种于培养皿中，细胞融合达至 80%左右，分别给予0、2、4、6、8 Gy 的射线照射，继续培养约2 w
12、，用吉姆萨染色 30min，在低倍光学显微镜下计数50个细胞的集落。克隆形成率(PE)=克隆数/接种细胞数100%，存活分数(SF2)=照射剂量组的集落数/(该组细胞接种数未照射组 PE)。采用 Gragh-Pad Prism5 软件，按单击多靶模型拟合细胞存活曲线，SF2=1(1eD/D0)N，Dq=D0lnN。其中 D 为照射剂量(Gy)，D0 为平均致死剂量，Dq 为准阈剂量(代表存活的宽肩度)，N 为外推值。放射增敏比(SE)=单纯照射组 D0/联合照射组 D0。1.6流式细胞术检测细胞凋亡1.3 中各组细胞接种于 6 孔板中。分别给予 0、4 Gy 的射线照射，继续培养 48 h 按
13、试剂盒说明操作，置于流式细胞仪检测细胞凋亡率。1.7Western 印迹法检测蛋白表达提取各组细胞总蛋白，定量后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，每孔上样 40 l 蛋白样品，电泳结束后进行转膜，然后用脱脂奶粉封闭，洗膜后加入一抗孵育，然后加入二抗室温孵育，加入化学发光液显影，然后定影、成像;用 Quantity-One 软件分析蛋白条带灰度值，计算蛋白的相对表达量。1.8双荧光素酶报告实验构建 FAM201A 及 GA-TA6 的野生型和突变型荧光素酶报告载体，将其分别与 mi-146a-5p 及 mi-NC 共转染至直肠癌细胞SW837 中，按试剂盒说明检测荧光素
14、酶活性。1.9统计学分析采用 SPSS20.0 软件行 t 检验。2结果2.1FAM201A、mi-146a-5p 和 GATA6 在直肠癌组织中的表达与癌旁组织相比，直肠癌组织中 FAM201A和 GATA6 mNA 表达水平显著升高，mi-146a-5p 表达水平显著降低(P0.05)。见表1。2.2干扰 FAM201A 对直肠癌细胞放射敏感性及凋亡的影响与 si-NC 组相比，si-FAM201A 组 0Gy、4 Gy 直肠癌细胞集落形成数及 2、4、6、8 Gy 细胞存活率显著减少，细胞凋亡率显著升高(P 0.05)。见表 2、表 3、图 1。单击多靶模型拟合计算得出(表 4)，si-
15、FAM201A 组 SE 为 1.885。表 1FAM201A、mi-146a-5p 和GATA6 在直肠癌中的表达(xs，n=23)组别FAM201Ami-146a-5pGATA6癌旁组织102003101004104003直肠癌组织386032028009309010t 值42 3773554794 168P 值000100010001表 2干扰 FAM201A 对直肠癌细胞存活率的影响(xs，n=5，%)组别0 Gy2 Gy4 Gy6 Gy8 Gysi-NC 组1000000083 26235576828616 951 77537124Si-FAM201A 组99990 0120 531
16、02319076134035035006t/P 值2236/0.0568693/000141 174/000119 346/00019042/0001596张丽等干扰 FAM201A 通过调控 mi-146a-5p/GATA6 影响直肠癌细胞生物学行为第 3 期表 3干扰 FAM201A 对直肠癌细胞集落形成、凋亡及 FAM201A、mi-146a-5p、GATA6 表达的影响(xs，n=5)组别集落形成数(个)0 Gy4 Gy凋亡率(%)0 Gy4 GyFAM201Ami-146a-5pGATA6 蛋白si-NC 组124.337.41105.006.167.590.5612.790.681.000.001.000.000.640.05si-FAM201A 组74.332.6243.002.1619.511.0026.171.130.240.023.410.070.180.02t 值11.01916.45118.01417.57265.81859.63214.795P 值0.0000.0000.0000.0000.0000.0000.000A:干扰 FAM201A 抑制直肠癌细胞集落
