1、重度子痫前期孕妇胎盘中 mi 296 3p 和 MMP9 的表达及临床意义辛怀丽李绪清芮月菊杨鹤王伟丽作者单位:236800安徽亳州亳州市人民医院妇产科(辛怀丽，芮月菊，杨鹤，王伟丽)230022安徽合肥安徽医科大学第一附属医院妇产科(李绪清)摘要 目的探讨 mi 296 3p 和基质金属蛋白酶 9(MMP9)在重度子痫前期(sPE)孕妇胎盘组织中的表达及临床意义。方法选取 2021 年 1 月至 2022 年 1 月在亳州市人民医院住院并剖宫产分娩的 sPE 孕妇 52 例为 sPE 组，另选取正常妊娠剖宫产分娩的孕妇 52 例作为对照组。应用逆转录聚合酶链反应(T qPC)检测两组孕妇胎盘
2、组织中 mi 296 3p 和 MMP9 mNA的表达情况，蛋白质免疫印迹(Western blot)检测 MMP9 蛋白的表达水平。采用 Pearson 法分析 mi 296 3p 与 MMP9 的相关性，以及两者与 sPE 孕妇的临床特征和妊娠结局的关系，双荧光素酶报告系统检测 mi 296 3p 和 MMP9 的靶向关系。结果sPE 组mi 296 3p 相对表达量高于对照组(0 72 0 10)比(0 35 0 07)，sPE 组 MMP9 mNA 和蛋白表达均低于对照组(0 21 0 06)比(0 57 0 10)，(0 16 0 06)比(0 65 0 08)，差异有统计学意义(t
3、=22 336、22 360、35 602，P 均 0 001);mi 296 3p 和 MMP9 mNA 的表达呈负相关(P 0 05);sPE 胎盘组织中 mi 296 3p 表达与收缩压和舒张压呈正相关(P 均 0 05)，与新生儿出生体质量和分娩孕周呈负相关(P 均 0 05)，sPE 胎盘组织中 MMP9 mNA 的表达与收缩压和舒张压呈负相关(P 均 005)，与新生儿出生体质量和分娩孕周呈正相关(P 均 0 05)。荧光素酶报告基因实验证实 MMP9 是 mi 296 3p 靶基因。结论mi 296 3p 高表达、MMP9 低表达与 sPE 的严重程度和预后相关，推测 mi 29
4、6 3p 可能通过负调控 MMP9 的表达参与 sPE 的发生发展。关键词 重度子痫前期;胎盘;mi 296 3p;基质金属蛋白酶 9doi:10.3969/j.issn.1000 0399.2023.02.018重度子痫前期(severe preeclampsia，sPE)是子痫前期严重程度的一种表现，是导致孕产妇和围产儿死亡率增加的主要原因1 2。目前，这种疾病的发病机制仍不清楚。然而，先前的研究3 表明，sPE 的发生可能与子宫螺旋动脉重塑障碍、胎盘浅着床和血管内皮细胞损伤等有关。研究4 显示，胎盘中 miNA 的表达失调可能导致 sPE 的发生。Choi 等5 通过高通量NA seq
5、测序发现 miNA 在 sPE 孕妇胎盘组织中存在差异表达，mi 296 3p 是其中之一。基质金属蛋白酶 9(matrix metalloproteinases，MMP9)可通过影响胎盘功能导致子痫前期的发生6。根据 miNA 靶向基因预测软件发现，MMP9 可能是 mi 296 3p 所调控的靶基因之一，两者对 sPE 的影响尚未明确。本研究通过检测 sPE 与正常孕妇胎盘组织中 mi 296 3p和 MMP9 表达，进一步分析对 sPE 孕妇相关临床特征的影响及两者的关系，探讨 mi 296 3p 和 MMP9在 sPE 发病中的作用，为 sPE 的发病机制和治疗提供新的思路。1资料与方
6、法1 1一般资料选取 2021 年 1 月至 2022 年 1 月在亳州市人民医院住院并剖宫产分娩的 sPE 孕妇 52 例为 sPE 组，另选取正常妊娠剖宫产分娩的孕妇 52 例作为对照组，sPE 具体诊断标准见妊娠期高血压疾病诊治指南(2020)8。与对照组相比，sPE 组孕妇血压升高，新生儿出生体质量降低，差异均有统计学意义(P均 0 05);两组孕妇的年龄、产次、孕次、孕前身体质量指数(body mass index，BMI)和分娩孕周差异无统计学意义(P 0 05)。见表 1。表 1sPE 组与对照组一般资料比较变量sPE 组(n=52)对照组(n=52)t 值P 值年龄(岁)26
7、88 3 5726 31 3 400 0840 402孕次(次)2 13 0 742 08 0 840 3720 711产次(次)1 46 0 541 44 0 610 1700 865Pre BMI(kg/m2)22 96 2 2222 68 2 680 5820 562收缩压(mmHg)162 35 10 33115 21 13 2720 2120 001舒张压(mmHg)116 98 6 8878 60 6 4529 3520 001分娩孕周(周)37 53 1 2237 89 0 891 7290 089新生儿出生体质量(kg)2 57 0 333 09 0 417 0990 001注
8、:sPE 为重度子痫前期;Pre BMI 为孕前身体质量指数。791第 44 卷第 2 期安徽医学2023 年 2 月Anhui Medical Journal12sPE 纳入与排除标准纳入标准:均为单胎妊娠;无胎儿发育异常;孕期无吸烟及饮酒史;孕期无特殊合并症。排除标准:孕前存在糖尿病、高血压和心脏病;孕前存在系统性红斑狼疮等风湿免疫性疾病;孕前存在肾脏、肝脏等相关疾病。本研究经亳州 市 人 民 医 院 伦 理 委 员 会 批 准(伦 理 编 号:2022056)，且均知情并签署知情同意书。1 3方法1 3 1标本收集选择胎盘母体面无钙化区，用无菌生理盐水快速清洗血凝块和血液，用一次性手术刀
9、片在距脐带根部约 2 cm 处的胎盘母体面取一块胎盘组织，大小约 1 cm3，放入冻存试管中，后将试管放入80冰箱冷藏备用。1 3 2总 NA 提取和逆转录聚合酶链反应(real timequantitative PC，T qPC)采用常规的 TIzol 法提取胎盘组织中的总 NA，然后用紫外分光光度计检测 NA 的纯度和浓度。1st Strand cDNA SynthesisKit(cDNA 链合成试剂盒，上海泽叶生物)合成 cDNA。采用热循环荧光定量 PC 仪(赛默飞 ABI7500)，根据日本 Takara 公司的 SYB Premix Ex Taq TM 手册对PC 反应混合液进行检
10、测。PC 的扩增条件为 95预变性5 min，开始循环 95 10 s、退火20 s，72延伸20 s，共45 个循环，72再次延伸3 min。采用2 Ct法计算其相对表达量并进行统计分析。mi 296 3p和 MMP9 以及内参引物均有广州锐博生物设计合成，mi 296 3p 上下游引物序列(退火温度 57):5 GAGGGTTGGGTGGAGGCTC TCC 3和 5AACGCTTCACGAATTTGCGT 3;U6 上下游引物序列:5 TGCGGGTGCTCGCTTCGCAGC 3 和5 CCAGT-GCAGGGTCCGAGGT 3;MMP9 上下游引物序列(退火温度59):5TCTAT
11、GGTCCTCGCCCTGAA 3 和5CATCGTCCACCGGACTCAAA 3;GAPDH 上下游引物序列:5AACGGATTTGGTCGTATTGGG 3 和5CCTG-GAAGATGGTGATGGGAT 3。1 3 3蛋白质免疫印迹(Western blot)检测提取部分胎盘组织的总蛋白，测定其浓度，并调整总蛋白量。变性后上样凝胶电泳，100 V 恒压转膜50 min，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，兔抗人 MMP9 单克隆抗体(1500，英国 Ab-cam 公司)，action 一抗(1 2 000，英国 Abcam 公司)4过夜，加入二抗(英国 Abcam 公司)，室温孵育1 h，使
12、用超敏 ECL 化学发光试剂盒显影液(上海碧云天公司)在伯乐凝胶成像系统显影(上海艾研生物科技公司)，使用Image J 分析蛋白灰度值，计算其蛋白质含量。1 3 4双荧光素酶报告基因实验通过 TargetScan8 0(https:/www targetscan org/vert_80/)预测 MMP9是 mi 296 3p 的靶基因之一，在 MMP9 3 UT序列中含有一个预测的 mi 296 3p 结合位点(47 53)。构建 MMP9 3 UT 的野生型(WT)和突变型(MUT)荧光素酶报告基因质粒(北京信诺金达生物科技有限公司)。将 HT 8/SVneo 细胞以每孔3 75 104个
13、细胞接种在 96 孔板中。使用 Lipo-fectamine TM 2000(Invitrogen，美国)分别将 MMP9 3 UT(WT;100 ng)和 MMP9 3 UT(MUT;100 ng)质粒与 mi 296 3p mimic(模拟物)或阴性对照物共同转染到 HT 8/SVneo 细胞中，进行双荧光素酶报告试验。孵育 48 小时后，使用全波长多功能酶标仪(JS THEMO Varioskan Flash，美国)检测荧光素酶活性。1 4统计学方法SPSS 26 0 和 GraphPad Prism 9 0用于所有数据的统计分析和作图，计量数据的结果表示为 x s，组间比较采用独立样本
14、 t 检验。计数资料采用例或百分比表示，采用 2检验。Pearson 检验 mi 296 3p 与 MMP9 mNA 表达的相关性以及两者与孕妇临床特征和妊娠结局的关系。以 P 0 05 表示差异有统计学意义。2结果2 1sPE 组和对照组胎盘组织中 mi 296 3p 与MMP9 mNA 的表达T qPC 检测发现，sPE 组和对照组胎盘组织中 mi 296 3p 的表达分别为(0 72 0 10)和(0 35 0 07)，差异有统计学意义(t=22 336，P 0 001)。对照组 MMP9 mNA 表达(0 57 0 10)，高于 sPE 组的(0 21 0 06)，差异有统计学意义(t
15、=22 360，P 0 001)。2 2sPE 组和对照组胎盘组织中 MMP9 蛋白的表达Western blot 结果显示，sPE 组 MMP9 蛋白表达水平低于对照组(0 16 0 06)比(0 65 0 08)，差异有统计学意义(t=35 602，P 0 001)。见图 1。注:sPE1 和 sPE2 组为重度子痫前期组;C1 和 C2 为对照组。图 1两组孕妇胎盘组织中 MMP9 的部分蛋白条带891辛怀丽等:重度子痫前期孕妇胎盘中 mi 296 3p 和 MMP9 的表达及临床意义第 44 卷第 2 期2023 年 2 月23mi 296 3p 和 MMP9 mNA 与 sPE 孕妇
16、临床特征和妊娠结局的关系在 sPE 组通过 Pearson 检验分析发现，mi 296 3p 和 MMP9 mNA 与孕妇收缩压、舒张压以及分娩孕周、新生儿出生体质量均有相关性(P 0 05)。见表 2。表 2mi 296 3p 和 MMP9 mNA 与 sPE 组孕妇临床特征和妊娠结局相关性指标收缩压舒张压分娩孕周新生儿出生体质量r 值P 值r 值P 值r 值P 值r 值P 值mi 296 3p0 3020 0300 3220 0200 4790 0010 3820 005MMP9 mNA0 2980 0320 3240 0120 2770 0470 4570 0012 4mi 296 3p 与 MMP9 mNA 的相关性sPE组孕妇胎盘组织中 mi 296 3p 的表达与 MMP9mNA 的表达量呈负相关(r=0 369，P 0 007)。见图 2。25mi 296 3p 与 MMP9 靶向关系的验证双荧光素酶报告基因实验进一步验证，与共转染 mimic NC 和 MMP9 3 UT WT 质粒组细胞比较，共转染mi 296 3p mimic 和 MMP9 3 UT WT 质粒组细
