1、Chinese Journa,of NeW Drugs 2O2332(2)138中国新药杂志 2023 年第 32 卷第 2 期 作者简介邱晓，女，副主任药师，主要从事生物制品药学审评工作。联系电话:(010)85243001，E-mail:qiux cde org cn。通讯作者韦薇，女，主任药师，主要从事生物制品药学审评工作。联系电话:(010)85243075，E-mail:weiw cde org cn。新药注册与审评技术重组蛋白生物制品灌流培养工艺及药学评价考量邱晓，赛文博，寇雅真，韦薇(国家药品监督管理局药品审评中心，北京 100022)摘要灌流培养作为一种连续细胞培养技术，较传统
2、批量生产工艺有利于企业生产成本控制，并可根据供应需求灵活调整规模。本文对比了传统批量发酵工艺与灌流工艺，明确了灌流培养工艺特点。结合国际人用药品注册技术协会目前正在起草的指导原则，本文从细胞传代稳定性研究、批次及规模定义、生产工艺控制、外源因子控制、生产工艺验证等方面，总结了灌流培养工艺药学评价的考量内容。关键词 灌流培养;连续生产;细胞传代稳定性;工艺控制;工艺验证 中图分类号 965 3 文献标志码 A 文章编号1003 3734(2023)02 0138 05Considerations on pharmaceutical evaluation of perfusion fermenta
3、tionof recombinant protein biological productsQIU Xiao，SAI Wen-bo，KOU Ya-zhen，WEI Wei(Center for Drug Evaluation，National Medical Products Administration，Beijing 100022，China)Abstract As a continuous cell culture technology，perfusion fermentation is more beneficial to cost controlthan traditional ba
4、tch fermentation and can be flexibly arranged according to the supply change In this paper，thecharacteristics and advantages of perfusion fermentation are clarified by comparing the batch fermentation withperfusion fermentation In combination with the guidelines currently being drafted by the Intern
5、ational Council onHarmonization，the considerations for pharmaceutical evaluation of cell passage stability study，batch and scaledefinition，process control，viral safety，and process verification of perfusion fermentation are summarized in thispaper Key wordsperfusion fermentation;continuous manufactur
6、ing;cell passage stability;process control;process verification重组蛋白类生物制品原液的生产传统上分为 2个主要步骤:上游(细胞培养和目标蛋白的表达)和下游(蛋白的纯化和制备成原液)。随着重组蛋白生物制品行业发展，人们对重组蛋白类生物制品的质量属性和工艺理解日渐累积，加之行业竞争日益激烈、成本压力增大、法规政策的变化等，部分重组蛋白类生物制品企业正在逐渐探索将传统的批量生产变更为连续制造。灌流培养是一种连续细胞培养工艺，目前，已有多个采用灌流培养工艺进行生产的重组生物制品在我国获批上市1，对于灌流培养工艺的药学评价，仍有待制定更为系
7、统的技术要求，目前国际人用药品注册技术协调会(InternationalCouncil on Harmonisation，ICH)指导原则原料药和制剂的连续制造 正在征求公众意见阶段，尚未发布正式版本2。美国 FDA 曾经就小分子和固体口服制剂的连续生产质控考量点发布了指导原则征求意见稿，提及部分考量要点也可供生物制品参考 3。此外，美国 FDA 就治疗用生物制品连续生产工艺中病毒去除/灭活的小规模验证问题进行了研究，并发表了研究论文4。我国尚无相关的指导原则可供Chinese Journa,of NeW Drugs 2O2332(2)139中国新药杂志 2023 年第 32 卷第 2 期参考
8、，笔者根据实际工作经验，并结合 ICH 相关指导原则，在本文中讨论了上游采用灌流工艺进行发酵生产，下游仍采用常规非连续批生产纯化模式的原液生产工艺的药学评价考量，以期对相关企业提供可供借鉴的参考。1灌流培养工艺特点目前重组生物制品常见的发酵模式为批量培养:批培养和补料批培养。在批培养生产模式下，细胞经接种、扩增后，在生物反应器中生长和表达，直到由于培养基消耗达到极限，细胞密度和活率开始下降。补料批培养发酵中，通过在培养过程中的不同时间点添加补料避免营养耗竭，因此，培养时间比批处理模式更长，最终生产率提高。无论是批培养还是补料批培养，随着培养过程的延长，由于细胞代谢产物会不断累积、渗透压会不断改
9、变等原因，一方面会使生物反应器中细胞密度及活细胞比例在达到一定数量后降低导致目的蛋白产量降低;另一方面由于培养环境的改变，可能导致细胞生长状态的改变，从而会影响产物质量的均一性。灌流培养过程是一种持续向生物反应器添加新鲜培养基，同时通过细胞保留装置截留细胞，持续分离含有目的产物和代谢产物的收获液的培养方式，因此可提供对细胞稳定且有利的生长环境，维持细胞密度和较高、较长的发酵时间5。相较于批培养及补料批培养模式，灌流培养可以在高细胞密度环境下长时间维持稳定培养环境6 7。在生产规模方面，批培养和补料批培养规模相对固定，若要提高生产规模需要通过新增生产线或新增产地等方式开展。而灌流培养生产规模可以
10、通过 4 个方面进行规模放大:在不改变收获液流速和设备情况下变更运行时间。在不改变整体运行时间和设备情况下增加收获液流量。增加设备(平行)放大。通过增加设备容量来放大规模。因此相对于批培养和补料批培养，灌流培养的生产当时更加灵活，有助于重组蛋白生物制品生产企业根据供应需求灵活调整规模2。批量培养的操作相对简单，且工业界目前对于批量培养的工艺及工艺控制有较多的实践经验，而灌流培养工艺对于工艺和过程的控制较复杂，且部分依赖于高度自动化的设备。灌流模式有利于工艺规模结合实际需求进行灵活调整，但需要大量的前期研究及验证工作来支持工艺规模的灵活调整。此外，由于灌流生产工艺发酵时间较长，对生产用细胞稳定传
11、代能力有更高的要求5，8。2灌流培养的药学审评考量2 1体外细胞传代周期限度灌流培养工艺的细胞传代周期限度的确定基本原则同批量培养一致，应结合小规模传代稳定性研究和实际生产终末代细胞的研究综合确定。对于小规模的细胞传代稳定性研究应该能够体现灌流发酵特点，通常的连续传代培养方法不能体现该工艺特点，可以利用线性缩小的生物反应器模拟实际生产开展连续培养以研究生产过程中的细胞传代稳定性。在细胞传代稳定性研究期间，一方面应确保小规模的工艺参数能模拟实际工艺参数;另一方面，因灌流培养通常可维持较长时间的发酵，因此小规模的发酵天数应覆盖实际生产的最大天数。在考察项目方面，除常规考察项目外，由于灌流培养不同时
12、间产物质量可能存在一定差异，因此不仅要考察培养结束时产物的质量(纯度、糖基化、活性、杂质)及遗传物质稳定性，还应该取发酵不同时间段的产物进行产物质量及遗传物质稳定性的研究，以更好反映连续灌流培养不同时间点产物特点，为下游合批、分批提供依据。此外，还应对实际发酵的不同过程中间体进行产品质量监测，并对生产终末代细胞进行遗传稳定性确认，并按照药典要求开展生产终末代细胞检定，以进一步结合实际工艺对细胞限传周期的限度进行合理控制。若采用灌流培养时存在侧传培养，则对于侧传培养细胞的传代稳定性研究中还应结合侧传培养工艺开展侧传培养的细胞传代稳定性研究，应将侧传培养与非侧传培养的细胞及产物进行横向比较，考察侧
13、传培养工艺是否会影响发酵的工艺及产品质量，结合研究结果合理确定侧传培养细胞的培养条件、传代周期限制等。2 2生产用原材料对于灌流培养工艺生产用原材料的控制除应按照药典 生物制品原材料及辅料质量控制 对生产用原材料进行分级控制外，考虑到部分培养基、缓冲液可能需要在配置后长时间放置备用，因此对于放置期间微生物限度、内毒素及原材料质量的变化情况应开展研究和控制，以确保不会因为原材料污染或质量的改变对灌流工艺造成非预期的工艺波动。2 3生产工艺2 3 1原液工艺规模和批次确定为了便于批次溯源和工艺控制，应根据工艺情Chinese Journa,of NeW Drugs 2O2332(2)140中国新药
14、杂志 2023 年第 32 卷第 2 期况明确灌流培养的规模，灌流培养原液的规模可以是相对固定的，也可以定义为一个范围。对于批次方面，起始自同一细胞库的一支或同时复苏多支生产用细胞，经过既定的扩增、发酵后，经单次或多次收获得到的发酵产物，根据供应需求或下游纯化规模，可加工成一批或多批原液。对于发酵规模的确定方面，几种常见的灌流培养模式的考量如下。2 3 1 1生物反应器数量固定，发酵天数固定这种情况下灌流的放液速度通常是固定的工艺参数范围，因此收获液的总体积相对固定，发酵规模相对固定，在发酵阶段应结合反应器数量、发酵天数，说明每批收获液的规模。2 3 1 2生物反应器数量固定，发酵天数不固定这
15、种情况下要明确生物反应器的数量、产物收获的时间范围，相应地说明收获液的产量范围。2 3 1 3生物反应器数量不固定，发酵天数固定这种情况下，首先要确定发酵的时长和生物反应器的数量范围，其次要关注是否所有生物反应器都是同时进行发酵，对于存在侧传培养的发酵工艺，可能各个生物反应器发酵起始时间不完全相同，要关注所有生物反应器是各自固定发酵时间，还是所有生物反应器在同一时间结束发酵。2314生物反应器数量不固定，发酵时间不固定这种情况下相对比较复杂，要确定生物反应器的数量范围和发酵时间的范围，考虑是否存在侧传，应确保各个生物反应器的细胞传代均在限制范围内。灌流培养的原液生产，在收获和纯化阶段可能存在多
16、步分批、合批操作，为了更加准确表达分批、合批策略，可采用图示的方法对涉及分批、合批的工艺步骤进行说明，并对不同阶段的规模，允许分批、合批的总操作次数进行说明。为了确保产品的可溯源性及产品的批间一致性，应建立良好的物料可追溯性、工艺监测和物料分流策略。有研究表明在培养基、培养条件、起始细胞等相同的情况下，与批量培养工艺相比，灌流培养产品的异质性程度较低，但灌流培养过程中随着生产用细胞胞龄的延长，细胞代谢同样会发生一定程度的改变，进而造成不同胞龄产物的糖基化等翻译后修饰类型和比例、聚体和片段等杂质的相对含量也会发生变化5。对于重组治疗用生物制品而言，质量属性的差异可能对安全性、有效性产生影响，因此在分批、合批的过程中要结合实际监测结果考虑源自不同胞龄来源中间体合适比例的混批，为了确保混批后产品质量符合后续加工要求，确保工艺的批间一致性能力，可考虑采用合适的质量指标对混批后中间产品进行过程控制，结合工艺能力设置可接受范围。2 3 2原液生产工艺2 3 2 1工艺参数及过程控制灌流培养工艺需要维持较长时间的动态稳态培养环境，工艺的稳健性依赖于有效的工艺和过程控制，应基于工艺研究在合适的时间对工
