1、浙江农业学报 Acta Agriculturae Zhejiangensis，2023，35(1):79 89http:/www zjnyxb cn林东璞，臧要强，张霄鹏，等 红苞凤梨 AbF35H 基因上游调控因子筛选 J 浙江农业学报，2023，35(1):79 89DOI:10.3969/j issn 1004-1524.2023.01.09收稿日期:2022-03-28基金项目:国家自然科学基金(31971704，31770743)作者简介:林东璞(1998)，男，山东聊城人，硕士研究生，研究方向为观赏植物分子生物学。E-mail:373057871 qq com*通信作者，马均，E-
2、mail:422572009 qq com红苞凤梨 AbF35H 基因上游调控因子筛选林东璞，臧要强，张霄鹏，周徐子鑫，马均*(四川农业大学 风景园林学院，四川 成都 611100)摘要:颜色是观赏植物最重要的性状之一，也是当前观赏园艺育种的一个重要方向。为研究红苞凤梨红蓝色彩的呈现机制，初步分析金边红苞凤梨(Ananas comosus var bracteatus)不同组织中花青素种类与含量，用AbF35H 基因启动子构建诱饵载体，利用酵母单杂交(Y1H)文库筛选其上游调控转录因子;并采用酵母单杂交验证技术，验证筛选出的转录因子与 AbF35H 启动子的互作关系。结果表明:花青素的种类组成
3、和相对比例决定了组织的颜色性状，AbF35H 是花青素合成途径种类分支的关键基因，在花青素种类组成与相对比例调控中具有重要作用;AbBTB/POZ、AbHSP81-1 和 AbGLOX 能够与 AbF35H 的启动子结合而调控其转录，可能在红苞凤梨花青素合成代谢调控中发挥重要作用。研究结果对于进一步揭示红苞凤梨花青素合成代谢调控机理，研究红苞凤梨呈色机理，培育叶色新品种有着重要的理论和实践意义。关键词:红苞凤梨;F35H 基因;花青素;酵母单杂交;调控因子中图分类号:S682.36文献标志码:A文章编号:1004-1524(2023)01-0079-11Screening of upstrea
4、m regulators of AbF35H gene in Ananas comosus var bracteatusLIN Dongpu，ZANG Yaoqiang，ZHANG Xiaopeng，ZHOU Xuzixin，MA Jun*(College of Landscape Architecture，Sichuan Agriculture University，Chengdu 611100，China)Abstract:Color is one of the most important traits of ornamental plants and also an important
5、 direction of ornamentalhorticulture breeding To investigate the presentation mechanism of red-blue color of Ananas comosus var bracteatus，the primary analysis of the kinds and concentration of anthocyanins in different tissues had been made，the promoterof AbF35H was used to build the bait vector，an
6、d the yeast one-hybrid(Y1H)library was used to select the tran-scription factors that control the genes upstream activity;The yeast one-hybrid technique was used to verify the inter-action between the selected transcription factors and the AbF35H promoter The results showed that the phenotypiccolor
7、of the tissues were determined by the kinds and relative proportion of anthocyanins AbF35H was a key genefunctioned in the species branch determination of the anthocyanin synthesis pathway，and was crucial for regulatingthe kinds and relative proportion of anthocyanins;AbBTB/POZ，AbHSP81-1 and AbGLOX-
8、like could bind to thepromoter of AbF35H to regulate its transcription，suggesting that they might play important role in the regulation ofanthocyanin anabolism in A comosus var bracteatus These results had important theoretical and practical signifi-cance in understanding the regulation mechanism of
9、 anthocyanin biosynthesis，investigating the color formation mech-anism and cultivating new leaf color variants of A comosus var bracteatusKey words:Ananas comosus var bracteatus;F35H;yeast one-hybrid;regulatory factor红苞凤梨(Ananas comosus var bracteatus)是一种来源于热带的凤梨属多年生常绿草本观赏植物，因其果型独特、色彩艳丽、株型优美而成为重要的新型
10、观赏植物，果枝作鲜切花保鲜可达 1个月以上，也是新型的切花植物1。金边红苞凤梨具有绿白镶嵌的金边嵌合叶片，叶果兼赏2，叶片在春秋季和花期会因花青素的积累而呈现出红色，叶片色彩显著，观赏期长，极大地提高了红苞凤梨的观赏价值3 4。植物的颜色由组织细胞中不同种类的色素以一定的比例组合形成，而在以红-紫-蓝色系为主的观赏植物中，花青素的种类和含量起主导作用5。近年来，植物颜色的研究主要集中在花青素的生物合成代谢途径上，通过分子手段对观赏植物的颜色性状进行改良。在具体应用方面，蓝色观赏植物的培育仍然是业内的一大热点，前人研究认为植物产生蓝色性状需要 3 个条件:呈色物质飞燕草素的积累、黄酮醇或者黄酮糖
11、苷等物质的积累和较高的 pH 值6 7。类黄酮 3 5-羟化酶(flavonoid 3 5-hydroxylase，F35H)是花青素生物合成途径中的关键酶，可通过与二氢山奈酚反应生成二氢杨梅素，后续生成蓝色飞燕草色素，对植物蓝色表型的形成起到举足轻重的作用，因此 F35H 基因又被称为蓝色基因8。Hol-ton 等9 于 1993 年将矮牵牛 F35H 基因导入缺少该基因的粉色系矮牵牛中，使得飞燕草色素大量积累，花色最终呈现蓝紫色。Okinaka 等10 将风铃草、矮牵牛和洋桔梗的 F35H 基因导入本氏烟草后发现，风铃草的 F35H 基因可以在烟草中高效表达，从而使烟草花瓣中飞燕草色素大量
12、积累，经测量飞燕草素含量约为转基因前的 2倍。F35H 基因的表达水平很大程度上决定了花青素的种类组成和飞燕草素的相对含量，而在高等植物中，基因的表达水平受到多种因素的影响，其中转录水平调控基因表达的研究较为深入，在目前对 F35H 基因的表达调控研究中已发现 MYB、bHLH、WD40 家族转录因子对 F35H的表达起到重要的调控作用11 13。酵母单杂交技术起源于酵母双杂交技术，主要应用于研究调控基因的上游转录因子，该技术依据酵母 GAL4 转录因子的结构域特性，通过将诱饵载体和 cDNA 文库连接后观察报告基因的表达情况来判断文库内是否存在调控该基因的上游转录因子14。目前酵母单杂交技术
13、已广泛应用于研究植物代谢途径和调控机理方面，郭育强等15 通过构建木薯酵母单杂交文库并用 MeC-WINV6 启动子片段进行筛库工作，筛选出 3 个转录因子和 1 个线粒体受体，为进一步研究提供了候选转录因子;郭荣荣等16 为研究葡萄成花调控机理，对夏黑葡萄 VlTFLlA 基因启动子进行了筛库工作，最终选出 9 个调控因子;李晓雪17 通过酵母单杂试验筛选出 DkMYB9 转录因子，后续通过双荧光素酶试验，证明了 DkMYB9 与目的基因存在相互作用。红苞凤梨的花瓣为蓝色，叶片和苞片为红色，呈现出不同的花青素积累特性。本研究对红苞凤梨不同颜色的组织进行花青素种类与含量的测定，厘清花青素的种类
14、组成和相对含量对组织颜色的决定作用;并对红苞凤梨 AbF35H 基因及其启动子序列进行克隆，将序列结果进行生物信息学分析;根据分析结果构建诱饵载体后进行酵母单杂交筛选，筛选调控 AbF35H 基因的上游转录因子;对筛选出的上游转录因子采用酵母单杂交验证互作关系，以期为 AbF35H 基因表达调控机制的研究提供候选转录因子。1材料与方法1.1材料金边红苞凤梨种植于四川农业大学试验苗圃。DH5 感受态细胞、Y1H 酵母感受态细胞、pAbAi 质粒均购买于 Solarbio 公司，DL marker2000、DL marker 5000 与核酸染料采购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司，金担子素 Ab
15、A、In-sert Check Mix 1 酶采购于索莱宝生物工程(大连)有限公司。1.2花青素种类与含量测定于2021 年10 月红苞凤梨颜色最鲜艳时分别选择红苞凤梨红色叶片、红色苞片和紫色花瓣组织进行取样，材料分别取自 3 棵不同植株作为重复。对植物材料进行真空冷冻干燥处理，处理后研磨成粉末状，将粉末溶于提取液(80%甲醇水溶液，含 0.1%盐酸)后涡旋振荡 10 min，超声处08浙江农业学报第 35 卷第 1 期理 10 min 后离心取上清液，过滤后使用 LC-ESI-MS/MS 分析。色谱条件:色谱柱 ACQUITY BEHC18 1.7 m，2.1 mm 100 mm;流动相 A
16、 相为超纯水(加入 0.1%甲酸)，B 相为甲醇(加入 0.1%甲酸);洗脱梯度:0 min B 相比例为5%，6 min 时增至 50%，12 min 时增至 95%，保持 2 min，14min 时降至 5%，并平衡 2 min;流速控制在 0.35mL min1;柱温 40;进样量 2 L。该方法能够检测到极性高、热稳定性差的化合物，并能够对物质进行精确定量。花青素在植物体属于次级代谢物，液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)能够满足花青素准确定性和定量的要求18。1.3红苞凤梨 AbF35H 基因克隆与分析以红苞凤梨植株的花瓣作为克隆材料，提取RNA 后使用试剂盒反转录为 cDNA 作为基因克隆模板，设置 3 个生物学重复。课题组前期已经完成红苞凤梨基因组测序、组装的相关工作19，通过本地化 Blast 比对在数据库中对符合 F35H基因特点的序列进行初步筛选，最终筛选出序号为 Aco_HBLgroup1g004620 的基因，经 CD-Search工具分析保守结构域初步判定该基因为 AbF35H。利用 Primer Premier 6.0 设计引物(AbF35H-F、AbF35
