1、39(1)111-121 中国生物防治学报 Chinese Journal of Biological Control 2023 年 2 月 收稿日期：2021-12-22 基金项目：国家自然科学基金（31672026，U21A20223，32011530117）；浙江省重点研发项目（2019C02015，2022C02047）；浙江省基础公益研究计划项目（LY20C140005）；中国计量大学科研标志性发展专项（2020YW27）作者简介：矫启启，硕士研究生，E-mail：。*通信作者，郝培应，博士，教授，E-mail：；俞晓平，博士，研究员，E-mail：。DOI:10.16409/ki.
2、2095-039x.2022.01.011 褐飞虱自噬相关基因NlATG4的表达与功能 矫启启，吴建艮，冯娅琳，俞飞飞，陈桐桐，郑园园，郝培应*，俞晓平*（中国计量大学生命科学学院/浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室，杭州 310018）摘要：ATG4 是一种半胱氨酸蛋白酶，负责 ATG8 蛋白羧基末端的切割，在自噬体形成过程中发挥重要作用。本研究克隆得到褐飞虱 ATG4 基因（NlATG4）的 cDNA 全长序列（GenBank 登录号:MF062502.1）。RT-qPCR 分析结果表明，NlATG4 基因在褐飞虱的若虫和成虫时期均有表达，12 龄若虫的表达量最高，在其他发育阶段的表达
3、量稍低。RNAi 结果显示，在 dsRNA 注射后的第 4 d，靶标基因 NlATG4 的表达量显著下降（仅为 dsGFP 对照组的 22%），同时，NlATG4 的 RNA 干扰导致虫体 ATP 含量显著降低，仅为1.0 mol/(Lmg 蛋白-1)，为对照组的 25%；在注射后的第 6 d，dsNlATG4 处理组的褐飞虱存活率出现显著降低，其脂肪体组织变得松散，大型脂滴（直径5.0 m）数量增多，类酵母共生菌周围泡状结构的界限基本消失；在注射后的第 8 d，dsNlATG4 处理的褐飞虱的存活率下降为 36.7%，比 dsGFP 对照组的存活率下降 53.3%。本研究表明靶向 NlATG
4、4 基因的 RNA 干扰会破坏褐飞虱脂肪体的结构完整性和类酵母共生菌的微环境，影响脂类物质代谢和 ATP 含量，并导致褐飞虱存活率降低。因此，NlATG4 基因在褐飞虱正常生长发育中发挥重要作用，在褐飞虱防治中具有一定的潜力。关 键 词：褐飞虱；NlATG4 基因；RNAi；脂肪体 中图分类号：Q96 文献标识码：A 文章编号：1005-9261(2023)01-0111-11 Expression and Function Analysis of Autophagy-related Gene NlATG4 in Brown Planthopper,Nilaparvata lugens(Hem
5、iptera:Delphacidae)JIAO Qiqi,WU Jiangen,FENG Yalin,YU Feifei,CHEN Tongtong,ZHENG Yuanyuan,HAO Peiying*,YU Xiaoping*(Zhejiang Provincial Key Laboratory of Biometrology and Inspection&Quarantine/College of Life Sciences,China Jiliang University,Hangzhou 310018,China)Abstract:ATG4,a cysteine protease,i
6、s responsible for the cleavage of the carboxyl terminal of ATG8 protein and plays an important role in the formation of autophagosomes.In this study,the full-length cDNA of ATG4 gene in the Nilaparvata lugens(NlATG4)was cloned(GenBank Accession No.MF062502.1).RT-qPCR analysis showed that the NlATG4
7、gene was expressed in both nymphs and adults and the expression level in the 1st to 2nd instar nymphs was the highest and slightly lower at other developmental stages.RNAi results showed that,at 4 d post treatment of dsRNA injection,the expression level of the target gene NlATG4 decreased significan
8、tly(about 22%of that of the dsGFP control)and the ATP content also significantly decreased to only 1.0 mol/(Lmg protein-1),about 25%of that of the dsGFP control.At 6 d post dsRNA treatment,the survival rate of the dsNlATG4-treated N.lugens decreased significantly in contrast to that of the dsGFP con
9、trol,the fat body became looser,and the number of large lipid droplets(diameter 5.0 m)increased,and the boundary of the bubble structure enclosing the yeast-like 112 中 国 生 物 防 治 学 报 第 39 卷 symbiont almost disappeared in dsNlATG4 treatment group.At 8 d post dsRNA treatment,the survival rate of dsNlAT
10、G4-treated N.lugens was 36.7%,53.3%lower than that for the dsGFP control.This study shows that RNA interference targeting NlATG4 gene breaks the structural integrity of fat body and the microenvironment of yeast-like symbiont,affecting lipid metabolism and ATP content,and reduces the survival of N.l
11、ugens.Therefore,NlATG4 gene plays an important role in the normal growth and development of N.lugens and has some potential in the control of N.lugens.Key words:Nilaparvata lugens;NlATG4;RNAi;fat body 褐飞虱 Nilaparvata lugens Stl 是一种水稻单食性害虫1，主要以稻株韧皮部汁液为食，在其摄食过程中，排出的蜜露会沾染水稻植株2，为病菌滋生创造有利条件，引发水稻病害3,4。随着近
12、代化学杀虫剂的普遍推广，褐飞虱对多种类别的杀虫剂均产生不同水平的抗性5。目前已有研究显示，褐飞虱对杀虫剂表现出的抗性可能由一个以上基因控制6。但随着褐飞虱逐代进化，杀虫剂又会失去原本的高杀虫效果7。由此可见，寻找一种能够降低褐飞虱生存能力及繁殖能力的新靶标，发展相应的控制褐飞虱种群数量的方法，显得尤为重要。自噬是指细胞质中的成分，包括细胞内可溶性大分子、细胞器和微生物等被溶酶体降解的一个过程8。自噬相关基因是细胞自噬过程中的关键执行因子，最先是在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中发现的9。ATG 基因家族是相对保守的，在酵母中发现的 38 个 ATG 基因，近一半可
13、以在哺乳动物和植物中找到其同源蛋白10。目前已有许多研究表明，自噬在昆虫的生长发育中具有多种重要作用，包括响应饥饿11,12、器官重塑13-15、抵御病原微生物的入侵16,17等。ATG4 是一种独特的半胱氨酸蛋白酶，在自噬体形成过程中负责 ATG8 羧基末端的切割18,19，并在ATG8 偶联系统中担任重要角色20,21。有研究表明，ATG4 在自噬囊泡扩张过程中起到重要作用22。ATG4B以 LC3B 依赖性方式定位到早期自噬，并通过影响 LC3B 的膜结合/解离来控制自噬小体形成的效率23。ATG4 的活性受活性氧调节24，酿酒酵母中活性氧可以可逆地抑制 ATG4 的活性19，人体中由饥
14、饿诱导的活性氧也可抑制 ATG4 的活性25。迄今，未见有关昆虫 ATG4 基因的报道，该基因在褐飞虱中的功能尚不明确，有待进一步探明。在本研究中，我们通过 RACE 法克隆了 NlATG4 基因全长 cDNA，应用 RT-qPCR 分析其在褐飞虱不同发育阶段的表达规律，利用 RNAi 技术研究敲减 NlATG4 基因表达量对褐飞虱的存活率带来的影响，通过透射电镜观察干扰 NlATG4 基因对脂肪体组织及其中类酵母共生菌的影响。本研究将揭示 NlATG4 在褐飞虱中的功能，评估其作为褐飞虱防治靶标的潜力。1 材料与方法 1.1 供试材料 本研究使用的褐飞虱由 TN1 水稻饲养，该褐飞虱群体已经
15、在 TN1 水稻上连续饲养 100 代以上。褐飞虱饲养在环境温度（261）、相对湿度（655）%、光周期 16L:8D 条件下的温室中。1.2 褐飞虱总 RNA 的提取 收集 TN1 水稻上不同发育阶段的褐飞虱（100 mg），使用 TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit 试剂盒，按照试剂盒的说明书对收集好的褐飞虱样本进行总 RNA 的提取。1.3 cDNA 的合成 使用 NanoDrop 2000 分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，美国）测量总 RNA 浓度并计算 1.0 g 总 RNA 的体
16、积，然后使用 PrimeScript RT Reagent Kit 和 gDNA Eraser（Takara,Tokyo，日本）合成 cDNA 第 1 链。合成后的 cDNA 样品保存至20 备用。1.4 NlATG4 基因的克隆及序列分析 1.4.1 cDNA 序列的克隆与鉴定 根据实验室前期的转录组数据，获得褐飞虱自噬相关基因 NlATG4 基因的部分核心序列，利用 Primer Premier 5.0 软件设计引物 NlATG4-F/R（表 1），对 NlATG4 基因的核心序列第 1 期 矫启启等：褐飞虱自噬相关基因 NlATG4 的表达与功能 113 进行 PCR 验证，PCR 扩增反应的体系（50 L）：Premix Taq 25 L，ddH2O 19 L，正反向引物（10 mol/L）各 2 L，cDNA 模板 2 L。PCR 扩增反应的程序：94 4 min；94 30 s，60 30 s，72 3 min，34 次循环；72 10 min，12 。在 1%琼脂糖凝胶中进行电泳，检验 PCR 扩增片段大小。将目的条带纯化后连接到 pMD-18T 载体上并进行转化，筛选出
