1、湖北省 20162021 年麻疹病毒流行株基因型特征张婷，邹文菁，徐军强，蔡昆，李静(湖北省疾病预防控制中心，湖北 武汉 430079)DOI:10.19914/j.CJVI.2023007通信作者:李静，Email:412836800 qqcom第一作者 Email:626817498 qqcom摘要:目的 分析湖北省麻疹病毒流行株基因型特征。方法 收集湖北省 20162021 年麻疹监测病例咽拭子标本，进行麻疹病毒核酸检测、分离培养、N 基因 C 末端基因扩增，构建分离株与基因库(GenBank)中麻疹病毒基因型参考株的系统进化树，分析核苷酸同源性和基因型别。结果 从湖北省 2016202
2、1 年麻疹监测病例中共获得 335 株麻疹病毒流行株，其中 H1 基因型 327 株(20162018 年)、B3 基因型 5 株(2019 年)、疫苗株 A 基因型 3 株(2016 年和 2021年)。H1 基因型麻疹病毒分离株之间的核苷酸同源性为 98.40%98.90%，与 H1 基因型参考株的核苷酸同源性为97.30%97.80%;B3 基因型麻疹病毒分离株之间的核苷酸同源性为 99.30%100%，与 B3 基因型参考株的核苷酸同源性为 97.10%97.60%。结论 20162018 年湖北省麻疹病毒优势流行株仍为中国本土 H1 基因型，2019 年首次发现 B3 基因型，202
3、1 年仅检测到疫苗株 A 基因型。需继续加强麻疹病毒基因型监测，及时发现和阻断输入性麻疹传播。关键词:麻疹病毒;基因型;核苷酸;同源性;监测中图分类号:511.1文献标识码:A文章编号:1006916X(2023)01003506Genetic characteristics of measles viruses circulating in Hubei province from 2016 to 2021ZhangTing，Zou Wenjing，Xu Junqiang，Cai Kun，Li Jing(Hubei Provincial Center for Disease Control a
4、ndPrevention，Wuhan 430079，Hubei，China)Abstract:Objective To analyze genetic characteristics of measles virus(MV)isolates in Hubei provinceMethods We collected throat swabs from measles cases reported between 2016 and 2021 in Hubeiprovince for MV nucleic acid detection，isolation and culture，and ampli
5、fication of the C-terminal N geneWe constructed a phylogenetic tree of the MV isolates with GenBank MV genotype reference strains todetermine nucleotide homologies and genotypesesults A total of 335 MV strains were obtained frommeasles surveillance cases from 2016 to 2021 in Hubei，among which 327 we
6、re H1 genotype(in 20162018)，5 were B3 genotype(in 2019)，and 3 were vaccine strain A genotype(in 2016 and 2021)Nucleotide homologies within H1 genotype isolates were 98.40%98.90%and were 97.30%97.80%between H1 genotype isolates and reference strains;homologies within B3 genotype isolates were 99.30%1
7、00%and were 97.10%97.60%between B3 genotype isolates and reference strainsConclusions Thepredominant MV strains from 2016 to 2018 in Hubei were indigenous H1 genotype MVs B3 genotypeMVs were found in 2019，but only A genotype was found in 2021 We should strengthen monitoring MVgenotypes for rapid ide
8、ntification and interruption of imported measles transmissionKey words:Measles virus;Genotype;Nucleotide;Homology;Surveillance麻疹是由麻疹病毒引起的儿童常见的发热出疹性疾病，是已知最具传染性的病毒性传染病之一。麻疹病毒感染后几乎都会出现临床症状，并可能导致严重甚至致命的并发症，特别是在人口处于营养不良状况下的发展中国家，每年仍有 11.5 万至16.0 万例患者死于麻疹。麻疹没有特定的抗病毒治疗措施1，接种含麻疹成分疫苗是预防麻疹的有效手段。自 2006 年中国实施消除
9、麻疹行动计划以53中国疫苗和免疫 2023 年 2 月第 29 卷第 1 期来，20082012 年中国麻疹消除工作取得了一定成果，但 2013 年麻疹发病有所回升2，当前中国仍处于消除麻疹阶段。2014 年湖北省麻疹发病率开始明显下降(2.10/10 万)，2017 年降至历史最低水平(0.30/10 万)，2018 年出现小幅回升且部分地区存在局部暴发疫情3。麻疹病毒属于副粘病毒科，麻疹病毒属;根据 N 基因 3 端 450 个核苷酸序列(N450)的 变 异，世 界 卫 生 组 织(World HealthOrganization，WHO)将麻疹病毒划分为 8 个基因组和 24 个基因型
10、4。2019 年以前 H1 基因型是中国麻疹病毒流行株的优势基因型，2009 年以来监测到多种输入性基因型5。本研究对 20162021 年湖北省流行的麻疹病毒基因型变化进行了分析，为麻疹免疫防控策略提供实验室依据。材料与方法1标本来源根据 湖北省麻疹监测实施方案，湖北省各地市州疾病预防控制中心(Center for disease control andprevention，CDC)及其所辖哨点医院采集 20162021 年麻疹监测病例的咽拭子标本(2020 年因受新型冠状病毒感染疫情影响未采集到标本)，由市级 CDC 人员冷藏运送至省级实验室，70保存备用。2病毒核酸提取和鉴定采用西安天隆
11、公司的全自动核酸提取试剂盒提取麻疹病毒核酸，具体操作参照仪器说明书进行。使用北京金豪生物科技股份有限公司的麻疹/风疹双通道荧光检测试剂盒检测麻疹病毒核酸，按照试剂盒说明书操作。3病毒分离培养取麻疹病毒核酸阳性咽拭子标本 200L接种于生长良好的 Vero/SLAM 细胞，置于 37 恒温培养箱吸附 1.5h 后弃标本液，加入 1.5mL 维持液，置于 37、5.0%CO2培养箱分离培养，每代培养 7d，在倒置显微镜下每日观察细胞病变。如果有特征性的麻疹病毒病变出现，并观察直到 75%的细胞发生变化，则置于70 冻存以备二次传代。若 7d 之后没有出现细胞病变，则阴性标本置于70冻融 3次后，继
12、续盲传 2 代，若仍为阴性，则判定该标本病毒分离结果为阴性。4N 基因序列扩增和分析使用 One step T-PC Kit 试剂盒(大连宝生物公司)扩增麻疹病毒 N450 片段，引物来源于中国 CDC 麻疹实验室。反应体系为 25L。反应参数:50逆转录 30min，94 预变性 3min;94 变性 30s，55 退火30s，72延伸 1min，30 个循环;72 后延伸 10min。扩增产物使用 1.5%琼脂糖凝胶进行电泳。将阳性 PC 产物送上海生工生物工程有限公司进行测序，测序结果使用 Chromas软件进行原始图谱核对，使用 Mega5.0 软件采用邻接法对N450 序列进行核苷酸
13、同源性分析，构建系统进化树。使用Megalign 软件计算核苷酸同源性。采用 Kimura 双参数模型(Kimura 2parameter model)分别比较湖北省麻疹病毒分离株之间及其与参考株之间的 N450 核苷酸序列，计算遗传距离(P-distance)。WHO 麻疹病毒各基因型参考株序列和中国麻疹病毒 H 基因型序列均来源于基因数据库(GenBank)。结果1麻疹病毒核酸检测和分离培养共采集 571 份 20162021 年麻疹监测病例咽拭子标本，其中 335 份(58.67%)标本的麻疹病毒荧光定量 PC 检测核酸阳性且 Ct 值25，其中十堰市274 份、孝感市 21 份、天门市
14、 12 份、荆州市 8 份、宜昌市 6 份、仙桃市 5 份、随州市 2 份、潜江市 2 份、襄阳市 1 份、咸宁市 1 份、荆门市 1 份、恩施州 1 份、神农架林区 1 份;335 份标本经分离培养，共获得 63株(18.81%)麻疹病毒株。2麻疹病毒基因型和系统进化分析对 335 份麻疹病毒核酸阳性且 CT 值25 的咽拭子标本进行 N450 片段扩增和测序，全部获得了N450 序列。选取同源性差异较大的各基因型代表株与 WHO 参考株构建基于 N450 片段的系统进化树显示，2016 年和 2021 年的 3 株(0.90%)麻疹病毒株(OM16M068、OM21M001 和 OM21M
15、002)与疫苗株 Shanghai191 位于同一分支，鉴定为麻疹病毒疫苗株 A 基因型;2019 年的 5 株(1.49%)麻疹病毒株与 B3 基因型参考株 MVi/IbadanNGA/0.97/1 位于同一分支，鉴定为 B3 基因型，为湖北省首次发现;20162018 年的 327 株(97.61%)麻疹病毒株与H1 基因型参考株 Mvi/HunanCHN/0.93/7/H1 位于同一分支，鉴定为本土流行的 H1 基因型(表 1、图 1)。湖北省 H1 基因型麻疹病毒株之间的核苷酸同源性为 98.40%98.90%;与 H1 基因型参考株Mvi/HunanCHN/0.93/7/H1 的 核
16、 苷 酸 同 源 性 为97.30%97.80%。将湖北省 B3 基因型麻疹病毒 N450 序列与其他国家和中国其他地区 B3 基因型流行株构建系统进化树显示，湖北省麻疹病毒 B3 基因型毒株与中国江西省流行株 MT359001、中国香港流行株MH898868、日本流行株 LC522519 聚在一个小分支上(图 2)。湖北省麻疹病毒 B3 基因型毒株之间的核苷酸同源性为 99.30%100%，与该小分支上的 3 株参考流行株的核苷酸同源性为 99.30%100%，而与 WHO B3 基因型参考株 Mvi/IbadanNGA/0.97/1 的 核 苷 酸 同 源 性 为 97.10%97.60%。63CHINESE JOUNAL OF VACCINES AND IMMUNIZATION Vol29No12023表 1湖北省 20162021 年麻疹病毒流行株的基因型构成年份检测标本份数阳性毒株数阳性率(%)H1 基因型株数构成比(%)B3 基因型株数构成比(%)A 基因型株数构成比(%)201644929265.0329199.6600.0010.3420179333.30310000.
