1、南 开 大 学 学 报（自然科学版）Acta Scientiarum Naturalium Universitatis NankaiensisVol.561Feb.2023第56卷第1期2023年2月文章编号:0465-7942(2023)01-0038-08黄芪治疗乳腺癌机制研究祖晓冬,闫东科(天津职业大学 生物与环境工程学院,天津 300410)摘要：基于网络药理学理论,采用生物信息学手段对中药黄芪中治疗乳腺癌有效成分及其机制进行探讨.一方面通过TCMSP中草药系统药理学平台筛选出黄芪的有效成分,另一方面通过GeneCards、OMIM、Phar-mGkb、TTD、DrugBank和Dis
2、GeNET等数据库查找与乳腺癌相关靶点.而后,利用筛选出的有效成分和靶点构建药物-成分-靶点-疾病网络图,借助STRING数据库平台探究蛋白质互相作用关系,并进行GO分析和KEGG 通路富集分析.采用分子对接技术将黄芪中的主要活性成分槲皮素与 JUN、RELA、ESR1、MYC、MAPK1、FOS、HIF1A、MAPK14、AKT1、CCND1和IL-2等靶点进行分子对接.最后进行槲皮素(quercetin)对人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-435细胞模型进行体外实验验证,结果表明黄芪可能主要是通过其活性成分槲皮素实现其抗乳腺癌的作用.本研究初步探讨黄芪治疗乳腺癌具有的多靶点、多通路的潜在作
3、用机制,可进一步为黄芪抗乳腺癌有效成分的筛选验证提供依据.关键词：黄芪;乳腺癌;网络药理学;机制;槲皮素中图分类号:R285文献标识码:A0引言2020年全球乳腺癌新发病例高达226万例,取代肺癌成为全球发病第一大癌症1.尽管由于激素疗法、靶向治疗等治疗策略的应用,乳腺癌患者的生存率逐渐提高,但是许多患者仍然面临复发,长期死亡率仍然很高的问题2.此外,这些疗法不适用于转移性或晚期乳腺癌患者3.现有的乳腺癌治疗药物有多种局限性,例如副作用、耐药性和缺乏选择性.因此,迫切需要开发安全、新颖的治疗乳腺癌的药物.在我国,得益于不良反应低、副作用小、局限性小等原因,传统中药广泛用于乳腺癌的辅助治疗,以提
4、高机体的免疫功能和改善病患生活质量.其中,黄芪作为临床常见抗乳腺癌中药材,取自豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根,富含多糖、三萜皂苷、黄酮类等多种物质.宋凯在体外MTT实验和形态学观察表明,黄芪提取物对MCF-7、SK-BR-3和MDA-MB-231细胞的增殖均有抑制作用,并且证明黄芪提取物通过 PI3K/AKT/mTOR 途径抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡4.郭超等人发现黄芪注射液对小鼠4T1乳腺癌细胞移植瘤生长有显著抑制作用,其机制与黄芪注射液下调Cyclin D1蛋白表达,促进肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤细胞增殖有关5.可见黄芪中含有成分确实对癌细胞有一定抑制作用,然而天然药物中多种成分以及各成分
5、抗肿瘤作用机制的复杂性对确定其疗效的分子机制增添了阻碍.因此,利用网络药理学体现的系统生物学原理与传统中医药理论中机体整体调控理念的共通性,厘清药物-成分-靶点-疾病间的关系,进行黄芪有效成分抗肿瘤作用的多靶点、多路径、多效应分析,对加速抗肿瘤中药的开发具有重要指导意义.1材料与方法1.1 数据库信息实验过程中使用的数据库和软件见表1.1.2 筛选黄芪中有效成分以及相应靶点通过TCMSP数据库进行中药材黄芪中活性成分信息的检索.具有潜力的的活性成分应具有优秀ADME收稿日期：2022-02-20基金项目：天津市教委科研计划项目（2021KJ089）作者简介：祖晓冬(1987-),男,河北保定人
6、,讲师,研究方向:药学化学.E-mail:第1期祖晓冬等:黄芪对乳腺癌作用机制研究 39 属性,其中 OB 值(oral bioavail-ability),即口服生物利用度就是其中之一,口服生物利用度高的药物在较低的给药剂量下就可以达到预期的药理学效果,同时可以降低药物的毒副作用,反之则不可预测的不良反应发生几率提升,在此选择以OB值30%为筛选标准.另外,DL 值(drug-likeproperties),即类药性,是活性成分成药的重要指标,潜力活性成分的结构和理化性质必须与体内药动学参数具有良好的相关性,以DL值0.18为筛选标准6.将筛选的得到的成分对应靶点相关基因通过Uniprot数
7、据库进行名称规范,去除重复基因后得到最终黄芪中有效成分相关靶点.1.3 乳腺癌疾病靶点获取和药物-疾病靶点映射基于GeneCards、DrugBank、TTD、PharmGkb、DisGeNET和OMIM数据库,对乳腺癌相关靶点进行检索.通过uniprot数据库对疾病靶点进行人类基因名进行关联转换后,通过R语言脚本(R-3.6.1软件)绘制维恩图来展示黄芪主要活性成分预测靶点与乳腺癌疾病相靶点交集之间的重叠关系.1.4 构建蛋白质互作网络(Protein-protein interaction,PPI)和预测黄芪抗乳腺癌核心靶点研究蛋白之间的相互作用网络,有助于挖掘核心的调控基因.蛋白质靶点之
8、间关系通过构建蛋白质互相作用关系(protein-protein interaction,PPI)网络进行分析预测.通过对1.3到的黄芪-乳腺癌共靶点进行PPI分析,导入STRING数据库,利用Cytoscape 3.9.1软件可视化,通过拓扑分析,得到药物-疾病作用核心靶点7-8.1.5 构建黄芪活性成分-乳腺癌靶点网络和预测主要活性成分利用STRING数据库,将1.3中得到的维恩图中展示出的黄芪和乳腺癌取交集获得的共同靶点导入,以研究物种设置为人类、以最低要求交互分数设置最高置信度0.9为限制条件9,检索已知蛋白间的互作关系,得到蛋白质互相作用关系网络相关信息,将其导入Cytoscape
9、3.9.1软件,将黄芪活性成分-乳腺癌靶点网络可视化并预测黄芪抗乳腺癌作用的主要活性成分.1.6 基因功能注释和通路富集分析为了进一步了解筛选出的黄芪活性成分作用于乳腺癌共靶点基因在生物学过程(biological process,BP)细胞组分(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)上产生的作用,进行GO基因注释富集分析,设定P值0.05,分别在以上三方面选取具有统计学意义的10项.同时,为了进一步了解筛选出的黄芪活性成分作用于乳腺癌共靶点基因在通路调控中的作用,进行KEGG信号通路富集分析,设定P值0.05,选取P值由小到大前3
10、0项.之后,利用Cytoscape 3.9.1软件对上述结果进行可视化分析.1.7 活性成分靶点分子对接验证将经过1.2筛选的活性成分作为配体,在pubchem下载其2D结构后,使用ChemBio3D Ultra14.0软件对2D结构进行三维建模,按照最小自由能进行预处理后得到能量最小化的配体三维结构.从RCSB PDB数据库获取1.4筛选出的黄芪活性成分乳腺癌作用关键靶点蛋白3D晶体构像,并利用PyMoL 1.7.6软件去水和加氢等预处理.将配体受体文件导入AutoDockTools 1.5.6软件并转换为pdbqt格式.最后通过Autodock vina 1.1.2软件进行分子对接,exh
11、austiveness 值设置为16,其他参数为默认值,利用PyMoL1.7.6软件对分子对接筛选出的最低结合能构像进行可视化分析10.1.8 体外细胞活性测定(1)试剂:乳腺癌 MCF-7和MDA-MB-435细胞(购自中科院上海细胞库)、二甲基亚砜(DMSO,美国数据库TCMSPGeneCardsOMIMPharmGkbTTDDrugBankDisGeNETSTRINGDAVIDUniprot中文名中药系统药理学数据库与分析平台人类基因综合数据库在线人类孟德尔遗传数据系统药物遗传学和药物基因组学知识库疗效靶点数据库综合性药物数据库与疾病相关的基因数据库蛋白质相互作用数据库注释可视化和集成发
12、现数据库蛋白质信息数据库数据库网址http:/ 本文采用数据库及网址Table 1 Databases and their URLused in this article 40 南 开 大 学 学 报（自然科学版）第56卷美国Sigma公司)RPMI1640培养基、胰蛋白酶和胎牛血清(Gibco公司)、活细胞计数法(CCK-8)检测试剂盒(美国Abbkine公司)、槲皮素(美国Sigma公司,纯度95%).槲皮素预处理:将槲皮素试剂用前溶于DMSO,配制成200 mmol/L母液,临用前用RPMI-1640培养基配置成所需浓度(DMSO浓度0.1%),过滤除菌.(2)取对数生长期乳腺癌 MCF
13、-7 和 MDA-MB-435 细胞以1104个细胞/孔接种96孔培养板,在剂量对照组(0 mol/L)和槲皮素组(20、40、80、160 mol/L)和时间依赖性实验中,检测MCF-7和MDA-MB-435细胞对槲皮素的反应能力,为期3 d.分别在培养24、48和72 h时加入CCK-8 试剂混匀,1h后用于450 nm处检测OD值,细胞活力(%)=实验组平均OD值/对照组平均OD值100%.2结果与分析2.1 筛选黄芪中有效成分以及相应靶点在TCMSP数据库中筛选出OB值30%、DL值0.18的黄芪有效成分及其对应靶点,将筛选得到的活性成分对应靶点相关基因通过Uniprot数据库进行名称
14、规范,去除重复基因后得到最终黄芪中有效成分相关靶点.由此得到黄芪中可能作用于乳腺癌的槲皮素(quercetin)、山萘酚(kaempferol)、芒柄花黄素(Formononetin)、白桦脂酸(mairin)等12种有效活性成分(见表2).2.2 乳腺癌疾病靶点获取和药物-疾病靶点映射通过 GeneCards、DrugBank、TTD、PharmGkb、DisGeNET、OMIM数据库分别搜索到乳腺癌相关靶点,其中人类基因数据库GeneCards获得12 178个靶点、药物标数据库TTD获得197个靶点、综合药物数据库DrugBank获得349个靶点、人类在线孟德尔遗传数据库OMIM获得11
15、3个靶点、药物遗传学和药物基因组学知识库PharmGkb获得311个靶点、人类疾病相关的基因与突变位点信息数据库DisGeNET获得2 293个靶点,把所有数据库中重复靶点基因删除后即获得乳腺癌疾病相关靶点基因(见图1).将得到的乳腺癌相关基因映射到2.1步骤得到黄芪中有效成分相关靶点,并通过R脚本软件可视化得到维恩图,分析可得药物-疾病共靶点合计170个(见图2).2.3 构建蛋白质互作网络(Protein-protein interaction,PPI)和预测黄芪抗乳腺癌核心靶点黄芪-乳腺癌170个关联靶点导入STRING数据库进行PPI分析,利用Cytoscape 3.9.1软件构建PP
16、I网络(图3),包括网络节点170个,即为170个关联靶点蛋白,网络连线549条,体现靶点之间的相互作用关系,平均节点度值6.46.将靶蛋白相互作用PPI网络导出TSV格式文件后通过 Cytoscape 3.9.1软件对PPI网络表2 部分黄芪治疗乳腺癌的活性成分(OB 30%,DL 0.18)Table 2 Some active compounds ofAstragalus mongholicus against breast cancerMOLIDMOL000211MOL000239MOL000296MOL000354MOL000371MOL000378MOL000387MOL000392MOL000398MOL000417MOL000422MOL000098英文名称MairinaranolHederageninIsorhamnetin3,9-di-O-methylnissolin7-O-methylisomucronulatolBifendateFormononetinIsoflavanoneCalycosinKaempferolquercetin中文名称白桦脂酸华良姜素常春藤
