1、第2 期蔡琛等:固相萃取-同位素稀释液相色谱-串联质谱法测定橄榄油中 4 种交链孢霉毒素含量及其分布状况15中国食物与营养2023，29(2):15-19Food and Nutrition in China基金项目:蚌埠医学院慢性非传染性疾病预防控制创新团队(项目编号:BYKC201901)。作者简介:蔡琛(1992)，女，在读硕士研究生，研究方向:流行病与统计。通信作者:吴学森(1964)，男，博士，教授，研究方向:流行病与统计。固相萃取-同位素稀释液相色谱-串联质谱法测定橄榄油中 4 种交链孢霉毒素含量及其分布状况蔡琛1，2，程先先1，吴学森1(1蚌埠医学院公共卫生学院，安徽蚌埠2330
2、00;2蚌埠市疾病预防控制中心，安徽蚌埠233000)摘要:目的:建立固相萃取-同位素稀释液相色谱-串联质谱法测定橄榄油中 4 种交链孢霉毒素含量的方法并描述其在橄榄油中的分布状况。方法:将橄榄油混匀后取 5 g(精确至 0.001 g)，经乙腈-磷酸二氢钠溶液混合溶液提取，固相萃取柱净化，收集净化液经水浴氮吹浓缩后，采用超高效液相色谱质谱仪测定，内标法定量。结果:交链孢菌酮酸(tenuazonic acid，TeA)在0 50 ng/mL、交链孢酚(alternariol，AOH)在 0 20 ng/mL、腾毒素(ten-toxin，TEN)在0 10 ng/mL、交链孢酚单甲醚(alter
3、nariol methyl ether，AME)在0 2 ng/mL 范围内线性良好(0.99)。TeA、AOH、TEN、AME 的检出限在0.20 2.00 g/kg 范围之间。4 种生物毒素加标回收率为 92.25%124.66%，精密度范围3.79%10.58%，表明本方法样本检测量小、灵敏度高、准确度高、精密度高，重现性好，是检测橄榄油中交链孢霉毒素的理想方法。结论:橄榄油普遍受到交链孢霉毒素污染，检出率 93.33%(28/30)，AME 毒素是橄榄油中最主要的检出毒素。关键词:固相萃取-同位素稀释液相色谱-串联质谱法;交链孢霉毒素;橄榄油交链孢霉在自然界中分布范围极其广泛，对一些植
4、物不仅具有腐生性，还具有致病性 1。低温条件下交链孢霉菌能够正常生长繁殖，因此在冷链储藏和运输过程中食品也会存在腐败和变质 2。该菌能产生多种有毒代谢产物，对人畜具有致癌作用并影响人畜健康。有研究表明，摄入被交链孢毒素污染的食品可能造成我国某些地区食管癌高发3。因此，食品中交链孢毒素的污染情况已成为重要的危害人体健康的公共卫生问题。橄榄油含有较高水平的单不饱和脂肪酸，研究表明，食用单不饱和脂肪酸有降低血糖4、调节血脂5、降低胆固醇6 等功效，越来越多居民选择橄榄油。20192020 年，我国已成为橄榄油进口量增长的第二大市场，我国将成为未来世界第一大橄榄油消费国7。本研究就固相萃取-同位素稀释
5、液相色谱-串联质谱法测定橄榄油中 4 种交链孢霉毒素含量及其分布状况进行分析。1食品污染中最常见的交链孢毒素污染食品的交链孢霉种类多种多样，其产生的交链孢毒素主要包括交链孢菌酮酸(TeA)、交链孢酚(AOH)、腾毒素(TEN)、交链孢酚单甲醚(AME)4类毒素8。2交链孢毒素的毒性大多数交链孢毒素对人体造成的急性毒性程度较低。但有研究表明，AOH、AME 对细胞产生遗传毒性9 和导致细胞突变 10。Feh 等11 研究认为，AOH 和AME 在微摩尔浓度下显著增加了人类癌细胞(HT29，A431)的 DNA 链断裂率，其中 AOH 有效地抑制了 DNA的松弛，并刺激了拓扑异构酶 I、II 和
6、II 的 DNA 裂解活性从而引起细胞 DNA 损伤。YEKELE 等12 研究认为，AME 和 TeA 对小鼠食道可能产生毒性影响。实验表明，每天给小鼠喂食 AME 或 TeA，持续 10 个月后，通过光镜检查，在 TeA 处理的动物中观察到中度和严重的发育不良，其特征是极性丧失、核多形性和超色性，表现为食管粘膜出现癌前病变。Lehmann 等13 用 AOH处理 V79 细胞，发现细胞分裂周期停滞在 G2 和 S 期。Wollenhaupt 等14 研究发现，AOH 对猪子宫内膜细胞的生存能力有影响。在用 AOH 处理后，S 期的细胞明显减少，而G(0)/G(1)期的细胞停滞，因此认为AO
7、H 在翻译水平上影响基因的表达。Liu 等15 发现，AME 和AOH 可与从人胎儿食道上皮细胞中分离出的 DNA 结合，激活其中的致癌物质 c-H-ras 和 c-mys，并在体外促进人胎儿食道上皮细胞的增殖，其次在食道癌高发区林县的DOI:10.19870/ki.11-3716/ts.20221008.00116中 国 食 物 与 营 养第29 卷粮食中分离出来的主要污染性真菌为 AOH 和 AME，因此认为进食被交链孢毒素污染的食品可能与中国某些地区食管癌高发有关。3材料与方法3.1材料与试剂3.1.1材料包装橄榄油，市场购买。3.1.2试剂细交链格孢菌酮酸(TeA，纯度 99%)、链格
8、孢酚(AOH，纯度 99%)、腾毒素(TEN，纯度99%)和交链格孢酚单甲醚(AME，纯度 99%)标准品，均购于美国 OME 公司;同位素内标:细交链格孢菌酮酸-D13(TeA-D13，纯度 99%)、链格孢酚-D2(AOH-D2，纯度 99%)、腾毒素-D3(TEN-D3，纯度 99%)、交链格孢酚单甲醚-D3(AME-D3，纯度 99%)、标准品，均购于加拿大 TC 公司;乙腈(色谱纯)、甲醇(色谱纯)，购于美国Thermor Fisher 公司;无水磷酸二氢钠(色谱纯)，购于天津科密欧化学试剂有限公司;碳酸氢铵(色谱纯)，上海罗恩化学试剂有限公司;磷酸(分析纯)，国药集团化学试剂有限公
9、司;0.05mol/L 磷酸二氢钠溶液(pH 3.0):称取6.0 g 无水磷酸二氢钠，溶解于950 mL 水中，用磷酸调节 pH 3.0，用水定容至1 000 mL，混匀;固相萃取柱(Waters Oasis HLB 200mg/6cc);样品提取液:取 550 mL 乙腈，加到 450 mL0.05 mol/L 磷酸二氢钠溶液(pH 3.0)中，混匀;水(符合 GB/T 6682 规定的一级水)。3.2仪器与设备Thermo Fisher 超高效液相色谱-串联质谱仪，美国ThermoFisher 公司，配有Hypersil Gold VANQUISH C18色谱柱(1.9 m，2.1 mm
10、 100 mm);超声波清洗器，上海科器仪器设备有限公司;多管涡旋混匀仪，上海净信实业发展有限公司;离心机，美国 ThermoFisher 公司;1/千电子天平，瑞士 Mettle 公司;50 mL 塑料离心管，浙江拱东医疗器械股份有限公司;Milli-QA10 超纯水器，美国 Milli-pore 公司;固相萃取仪，上海力辰邦西仪器科技有限公司;氮吹仪，上海乔跃电子有限公司;移液器(1 10、10 100、100 1 000 L)，德国 eppendorf 公司。3.3方法3.3.1超高效液相色谱条件色谱柱型号:HypersilGold VANQUISH C18液相色谱柱(100 mm 2.
11、1 mm，1.9m);柱温条件:40;流动相配比:A(1.0 mmol/L碳酸氢铵溶液)+B(甲醇)，采用梯度洗脱;梯度洗脱程序见表1;进样量:2 L;流速:0.25 mL/min。3.3.2超高效液相色谱-串联质谱条件离子化模式:采用电喷雾离子源(ESI);电离方式:负离子模式;质谱扫描方式:多反应监测(MM);电离电压:3 500V;离子源温度:350;鞘气流量:35 Arb;碰撞气流量:10 Arb;反吹气流量:1 Arb。4 种链格孢霉毒素及同位素内标物的保留时间、监测离子、锥孔电压和碰撞电压质谱参数如表2 所示。表1超高效液相色谱梯度洗脱程序时间(min)流速(mL/min)A(%)
12、B(%)0.00.259552.00.259553.00.2525754.00.2510906.00.2510906.50.25955100.25955表24 种交链孢霉菌毒素的质谱参数目标物保留时间(min)母离子(m/z)子离子(m/z)锥孔电压(V)碰撞能量(eV)TeA4.51196.1139.16819TeA-D134.51209.1143.06821AOH5.39257.0213.010322AOH-D25.38259.0215.010325TEN5.76413.0141.19719TEN-D35.76416.0141.19720AME6.17271.1256.07521AME-D
13、36.16274.1256.075223.3.3标准溶液的配制(1)同位素内标储备液:分别准确称取4 种交链孢霉毒素内标标准品，用乙腈溶解并定容，混匀，得到 TeA-D13 储备液(100 g/mL)、AOH-D2 储备液(100 g/mL)、TEN-D3 储备液(100g/mL)、AME-D3 储备液(100 g/mL)，密封后置于-20避光保存。(2)标准储备液:分别准确称取适量 4种链格孢霉毒素标准品，用甲醇溶解并定容，混匀，得到 TeA 标准储备液(100 g/mL)、AOH 标准储备液(100g/mL)、TEN 标准储备液(100 g/mL)、AME 标准储备液(100 g/mL)，
14、密封后置于-20 避光保存。(3)混合标准工作液(TeA:500 ng/mL，AOH:200ng/mL，TEN:100 ng/mL，AME:20 ng/mL):分别准确移取50 LTeA 标准储备液(100 g/mL)、20 LAOH储备液(100 g/mL)、10 LTEN 储备液(100 g/mL)、2 LAME 储备液(100 g/mL)至 10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混匀，密封后置于 4避光保存。(4)混合内标工作液(TeA-D13:500 ng/mL，AOH-D2:200 ng/mL，TEN:100 ng/mL，AME:20 ng/mL):分别准确移取 50 LTeA-D
15、13 标准储备液(100g/mL)、20 LAOH-D2 储 备 液(100 g/mL)、10LTEN-D3 储备液(100 g/mL)、2 LAME-D3 储备液(100 g/mL)至10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，第2 期蔡琛等:固相萃取-同位素稀释液相色谱-串联质谱法测定橄榄油中 4 种交链孢霉毒素含量及其分布状况17混匀，密封后置于-20避光保存。(5)标准曲线绘制:取适量混合标准工作液和混合内标工作液，用甲醇和水配置成标准系列，具体配置信息见下表 3。将标准系列溶液注入超高效液相色谱串联质谱仪，得到 4 种交链孢霉菌毒素的色谱图和峰面积。分别以 TeA、AOH、TEN、AME
16、 的浓度为横坐标，以 TeA、AOH、TEN、AME 的峰面积与各自内标峰面积之比为纵坐标，绘制 TeA、AOH、TEN、AME 标准曲线图。表34 种交链孢霉菌毒素标准系列的配置方法STD-0STD-1STD-2STD-3STD-4STD-5STD-6TeA(ng)0102050100200500AOH(ng)04.080204080200TEN(ng)02.04.0102040100AME(ng)00.40.82.04.08.020同位素内标(ng)TeA-D13:100，AOH-D2:40TEN-D3:20，AME-D3:4.0混合标准工作液加入量(L)020401002004001 000混合内标工作液加入量(L)200200200200200200200甲醇(L)800780760700700600定容用水定容至10 mL3.3.4样品前处理方法(1)提取:橄榄油置于常温避光保存，称样前需充分混匀。然后称取橄榄油 5 g(精确至0.001 g)于50 mL 刻度离心管中，加入100 L混合内标工作液，涡旋混匀 10 s，静置过夜。样品中加入25 mL 样品提取液，旋紧盖子，涡
