1、研究报告吉玉玉 等：贵州喀斯特山区野生葛藤根瘤菌的资源利用收稿日期：基金项目：贵州省农业科技支撑计划项目（黔科合支撑 号）；国家自然科学基金项目（）；贵州省农业科学院青年基金（黔农科院青年基金 号）；贵州省农业科学院青年基金（黔农科院青年基金 号）；贵州省科技支撑计划项目（黔科合支撑 号）；贵州省基础研究计划项目（黔科合基础 号）；科技基础资源调查专项“中国南方草地牧草资源调查”（）；国家牧草产业技术体系（）。作者简介：吉玉玉（），女（汉族），山东潍坊人；硕士，研究实习员，主要从事牧草微生物资源发掘与利用方面研究（：）。通讯作者：曾庆飞（），男（土家族），贵州德江人；博士，副研究员，主要从事植
2、物根际微生物资源的发掘与应用方面的研究（：）。贵州喀斯特山区野生葛藤根瘤菌的资源利用吉玉玉，曾庆飞，王海瑾，王佳楚函，欧二绫，韦兴迪，韦鑫，龙忠富（贵州省农业科学院草业研究所，贵阳 ；贵州大学动物科学学院，贵阳 ）摘要：为获得固氮促生能力强、寄主识别范围广的高效抗逆葛藤根瘤菌。本试验收集贵州省 个县（市）个不同生态功能区的葛藤根瘤样品，经分离纯化、基因序列比对、区系分析以及百脉根盆栽回接筛选获得高效抗逆葛藤根瘤菌。结果表明，分离纯化获得 株根瘤菌分属于属 种，区系分析优势属为慢生根瘤菌属（）和假单胞菌属（），分布频率均高达 ；优势种为根癌土壤杆菌（）和豆根瘤菌（），发生频率相对较高，分别达 和
3、 。盆栽回接筛选获得 株优良促生固氮葛藤根瘤菌，其中分离自荔波县驾欧乡的 与宿主植物的共生结瘤及促生长率均与另外 个优良菌株差异显著（），为最优固氮根瘤菌。关键词：葛藤；根瘤菌；区系分析；菌株筛选；贵州喀斯特山区中图分类号：文献标志码：文章编号：（），（，；，）：，（），.，DOI:10.13605/ki.52-1065/s.2022.06.033耕作与栽培第 卷第期 年 月 （），：；中国是世界上喀斯特地貌分布最广的国家之一，大陆上裸露、半裸露及埋于地下的碳酸盐岩分布面积约占全国总面积的三分之一，是我国亟需治理的生态脆弱区之一。贵州省地处中国西部山区高原与东部丘陵平原之间的过渡区域，属于典型
4、的喀斯特地貌，是中国西南地区喀斯特面积最大、生态环境最复杂的省份。研究表明，加快草地建设是喀斯特地区解决生态退化的有效途径。喀斯特地区石漠化的本质是土壤退化，氮素大量流失，植被恢复慢。豆科植物作为世界重要的饲草种类之一，在改善土壤理化性质、提高土壤肥力等方面也占据重要地位，还可作为先锋植物为其他植物定居提供必要生长条件，被广泛用于生态恢复与重建。豆科牧草野生葛藤（）作为一种优良的水土保持植物、饲草植物和药用植物种质资源，在贵州境内广为分布，具有生长迅速、根深叶茂、固氮增肥、改良土质等优良特性。根瘤菌豆科植物共生固氮系统是生物固氮的主要体系。葛藤以结瘤数高、固氮率高、固氮量多等优势改善石漠化地区
5、土壤结构，提高土壤肥力，用于荒山、荒滩改造和石漠化治理，在修复污染退化土壤和植被生态的恢复等方面发挥巨大的作用 。目前国内针对葛藤根瘤菌的研究多集中在其遗传系统多样性上，如谢徽 探讨了四川攀枝花地区葛藤根瘤菌的遗传多样性和系统发育地位；陈强等 证明了 株四川葛藤属根瘤菌的遗传特性存在明显差异；魏世清 深入研究了葛藤根瘤菌的耐酸性等。贵州省内关于葛藤主要集中在其作为饲用植物资源方面的研究，而针对环境特殊且资源丰富的贵州野生葛藤共生根瘤菌的研究还很缺乏。本研究利用采自贵州省不同生态功能区域的野生葛藤根瘤菌进行序列比对以及区系分析，并通过盆栽实验筛选出结瘤数多、固氮力强与促生效果优良的根瘤菌株，为贵
6、州喀斯特地区植被恢复提供优异种质资源，为石漠化治理提供研究基础。材料与方法试验区域与材料采集区域样品采集于贵州省 个县（市），遍布个不同生态功能区，不同生态区、采集地点及样品编号见表。共采集到 份野生葛藤根瘤样品。实验材料百脉根“歌德”种子购于贵州省某园林绿化公司；细菌基因组 抽提试剂盒购于北京百泰克生物技术有限公司；培养基本试验对酵母甘露醇琼脂（）培养基进行了改良，改良后的 液体培养基为：甘露醇，酵母粉，适量蒸馏水混合后，加配制好 的 （）、（）、柠 檬 酸 铁（）各，定容至 ，。分离纯化所用固体培养基则是在改良液体培养基的基础上，加入琼脂粉 ，刚果红（）混匀。样品处理及分离纯化样品处理：冲
7、洗葛藤根瘤样品后无菌水浸泡过夜。挑选 颗 单 个 根 瘤 依 次 用 酒 精、浸泡 。菌株分离：超净工作台内取无菌水冲洗过的单个根瘤，于无菌水的研钵中研磨成悬浊液，涂布于平板上，培养，待出菌后每天观察。菌株纯化：挑取单个菌落接种于新平板上，倒置培养直至形成单菌落，重复次，染色镜检（革兰氏染色试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司），获得纯化菌株。菌株保存：纯化菌株接种至液体培养基中，、培养后，甘油保种，冻存。种类鉴定及区系分析形态学鉴定镜检为红色的革兰氏阴性（）菌株，参照 微生物分类学 中鉴定方法，观察菌体形态特征。菌株 基因序列分析细菌基因组试剂盒提取菌株总 ，各菌株 采用通用引物进行 扩增，预变
8、性、变性、退火、延 伸 的 条 件 分 别 为：、；、；、，、，个 循 环；产 物 经研究报告吉玉玉 等：贵州喀斯特山区野生葛藤根瘤菌的资源利用表样品编号及采集地点概况样品编号采集地点东经北纬生态功能区 雷山雷公山 肇兴皮林 黎平高屯 东部亚热带常绿阔叶林生态区 天柱桥上 黎平大坡 黎平高洋 正安桴焉 中部亚热带喀斯特脆弱生态区 桐梓新站 北部亚热带常绿阔叶林生态区 仁怀鲁班 贞丰连环 西部亚热带针阔混交林与草山喀斯特脆弱环境生态区 册亨坡妹 册亨冗渡 册亨者楼 册亨达央 望谟麻山 罗甸董架 平塘卡蒲 平塘卡蒲 南部亚热带季雨林生态区 荔波驾欧 荔波小七孔 三都周覃 三都中和 从江洛香 独山下
9、司 独山麻尾 琼脂糖凝胶电泳检测后纯化回收后送北京擎科新业生物技术有限公司进行测序。测序完成后，利用 的 数 据 库、同 源 性 比 对，分析软件多重比对，最终结合菌体形态鉴定结果，确定各菌株的种属分类地位。区系分析根据种类鉴定结果，系统分析调查区域内葛藤根瘤菌的种类及分布情况。分布频率采用相对频率和发生频率分别计算，计算公式：相对频率（）（有某菌种发生的样品数有菌种发生的总样品数）；发生频率（）（有某菌种发生的菌株数鉴定出的菌株总数）。根瘤菌株的盆栽回接筛选供试菌株根瘤菌株的代谢功能特性因地理环境与种类不同而有所差异，又因回接筛选实验工作量较大，故供试菌株选择了不同地域、不同种类的具代表性的
10、葛藤根瘤菌。盆栽回接方法种子消毒：百脉根种子依次用酒精（）、次氯酸钠（）浸泡 、。菌液培养：供试菌株活化培养后，接种于 液体培养基中，、，培养。盆栽播种：在盛有灭菌珍珠石的花钵内播下种子，室温、光照 培养。种子发芽长出幼苗后浇入 全营养液（上海国药），周后每盆保留 株幼苗用于菌液回接处理。回接处理：以只浇灌无菌 液体培养基的花盆为空白对照（），每盆菌液回接（盆）的花盆为个处理，每个处理设个重复。每隔向花钵基质中浇灌少量的 营养液，仅保持基质湿润即可。菌液回接、盆栽生长 后取出盆内植株，用于回接效果测定。测定植株结瘤数及地上、地下生物量随机选取每一处理、每一重复中的个百脉根植株，空白对照选取株，
11、共计 株。统计并计算总瘤数及单株瘤数的平均值；分离地耕作与栽培第 卷第期 年 月上部分和地下根系，于烘箱中 杀青 ，降至 烘干至恒重，计算单株的地上和地下生物量的平均值。数据分析采用 软件整理数据，法进行多重比较，软件进行统计学分析。结果与分析形态特征经分离纯化和革兰氏染色鉴定，份根瘤样品共获得 个（）纯化菌株。参照 微生物分类学，通过对菌体形态进行显微观察，发现符合根瘤菌的基本形态特征。根瘤菌株的种类鉴定按照 的方法，个菌株的总 均形成 左右的条带以及扩增约 的序列片段。如表所示，通过菌体形态特征以及 序列比对，共鉴定出共生根瘤菌 株，根瘤内生细菌 株。区系分析结果如表所示，株野生葛藤根瘤菌
12、分属于个属 个种。个属分别为：根瘤菌属（）、慢生根瘤菌属（）、伯克氏菌属（）、中华根瘤菌属（）、土壤杆菌属（）、草 螺 菌 属（）和 假 单 胞 菌 属（）。其中慢生根瘤菌属和假单胞菌属的分布频率最高，同时达 ，为优势属；在 个种中，根癌土壤杆菌（）和豆根瘤菌（）两个种的发生频率相对较高，分别达 和 ，为优势种。表展示了个生态功能区葛藤根瘤菌的分类及种属分布结果。结果表明，南部干热河谷南亚热带季雨林生态区中鉴定出 、和 属中的 个种，种类最多；其次是鉴定出 、和 属中 个种的东部湿润亚热带常绿阔叶林生态区；而中部湿润亚热带喀斯特脆弱生态区和北部湿润亚热带常绿阔叶林生 态 区都 只 鉴定出 和
13、个属中的个种；西部半湿润亚热带针阔混交林、草山喀斯特脆弱环境生态区仅鉴定出 中的个种。共生结瘤固氮高效根瘤菌株的筛选供试菌株选用 株来自不同地域和不同种类葛藤根瘤菌表葛藤根瘤菌株种类鉴定结果菌株编号根瘤采集地种类鉴定结果 贞丰连环 册亨坡妹 册亨冗度 册亨者楼 册亨达央 册亨达央 望谟麻山 望谟麻山 望谟麻山 望谟麻山 罗甸董架 平塘卡蒲 平塘卡蒲 荔波驾 欧 荔波小七孔 三都周覃 雷山雷公山 雷山雷公山 黎平大坡 黎平大坡 三都中和 三都中和 黎平高洋 黎平高洋 正安桴焉 正安桴焉 正安桴焉 桐梓新站 仁怀鲁班 从江洛香 从江洛香 肇兴皮林 肇兴皮林 肇兴皮林 黎平高屯 黎平高屯 天柱桥上
14、独山下司 独山麻尾 研究报告吉玉玉 等：贵州喀斯特山区野生葛藤根瘤菌的资源利用表研究区野生葛藤根瘤菌种属分布特征生态功能区属名种名 .、.、.东部湿润亚热带常绿阔叶林生态区 .、.、.、.、.西部半湿润亚热带针阔混交林、草山喀斯特脆弱环境生态区 .中部湿润亚热带喀斯特脆弱生态区 .、.、.、.南部干热河谷南亚热带季雨林生态区 .、.、.、.北部湿润亚热带常绿阔叶林生态区 .用于百脉根幼苗的盆栽回接筛选实验。分别为：、。表葛藤根瘤菌株区系分析结果属名分布频率（）种名发生频率（）.葛藤根瘤菌株对百脉根共生结瘤及促生效果的影响菌液回接 后，百脉根植株的相关指标测定结果见表。结果表明，与 相比，个菌株
15、回接后对表百脉根盆栽回接筛选试验测定结果菌株名称根瘤个数（个）地上部干重（）地下部干重（）注：表中同列不同大写字母表示差异达极显著水平（），不同小写字母表示差异达显著水平（）。幼苗共生结瘤和生长均有不同程度的促进作用。单株平均根瘤数在 个之间。结果显示，个菌株（；耕作与栽培第 卷第期 年 月；）的结瘤促生效果较好，与其余菌株差异显著，为优良固氮菌株。其中分离自荔波县驾欧乡的 的结瘤数和促生效应与其余 个优良菌株差异显著，与另外个供试菌株的差异达极显著水平，为最优固氮根瘤菌株。讨论当前，葛藤在中国有 个种和个变种，亦有部分研究学者认为在国内有 个种，除新疆、西藏外，广泛分布于全国各省区。贵州葛藤
16、资源（年）调查结果表明贵州省内存在 个种。作为全国葛藤资源集中分布的主要地区之一，贵州省内关于野生葛藤共生根瘤菌的研究较少。贵州境内葛藤根瘤菌区系分析发现，个不同生态区的根瘤菌属、种数量各异，但每一个功能区中都存在根瘤菌属或假单胞菌属。已有的研究报道表明，与葛藤识别共生的根瘤菌存在着一定的优势种类，发现较多 的 是 慢 生 根 瘤 菌 属，同 时 也 有 根 瘤 菌 属 的 报道 ；在不同地区调查，葛藤根瘤菌均存在遗传多样性，在地 理分 布 上，也均 具有 明 显 的 生 物 学 分 布 格局 。本研究结果与已报道的研究结论有相似之处，慢生根瘤菌属是能与葛藤识别并共生的优势种类，但本研究结果还发现假单胞菌属中的部分种类也是与葛藤共生的优势种类，体现了贵州喀斯特地区的葛藤属根瘤菌资源存在着区域性的丰富性与特异性。进一步说明，与同一种豆科植物共生的根瘤菌资源，在不同的地区、不同的环境下均存在不同的优势种类，而根瘤菌在特定的生态地理环境下针对生物学地理分布、共生匹配效率与遗传多样性又会有显著的差异。因此，生态地理环境对共生根瘤菌资源的多样性具有重要的影响。丰富多样的生态环境、不同的地理生态条
