1、解剖学研究2023年第45卷第1期Anat Res,2023,Vol.45,No.1【摘要】目的研究桧木醇对乳腺癌MCF7细胞增殖和凋亡的影响及其相关机制。方法用0、5、10和20 mol/L桧木醇处理人乳腺癌MCF7细胞，采用划痕法检测细胞的迁移、Transwell法检测细胞侵袭能力、流式细胞技术检测细胞凋亡情况、采用蛋白免疫印迹法检测 TGF1/Foxp3/RORt 信号通路相关蛋白的表达。结果与对照组比较，5、10和20 mol/L桧木醇组细胞细胞划痕愈合率、侵袭能力均显著降低（P0.01或P0.05），且随着桧木醇浓度的升高，细胞划痕愈合率和侵袭能力逐渐下降，差异有统计学意义（P0.0
2、5）；细胞凋亡率显著升高（P0.01或P0.05），且随着桧木醇浓度的升高，细胞凋亡率逐渐升高，差异有统计学意义（P0.05）；TGF1、Foxp3、RORt 蛋白显著降低（P0.05），随着桧木醇浓度的升高，TGF1、Foxp3、RORt 蛋白表达水平逐渐降低，差异有统计学意义（P0.05）。结论桧木醇可以通过抑制乳腺癌细胞中 TGF1/Foxp3/RORt 信号通路来调节乳腺癌细胞的侵袭、迁移和凋亡，具有成为乳腺癌免疫治疗的潜在靶点。【关键词】桧木醇；乳腺癌；MCF7细胞；凋亡；TGF1/Foxp3/RORt通路DOI：10.20021/ki.16710770.2023.01.08Lina
3、lool may affect breast cancer cell invasion，migration and apoptosis through TGF1/Foxp3/RORtpathwayZHU Zhichuan1，ZHANG Xiping21Department of General Surgery，Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University，Hohhot，Inner Mongolia010050，China；2Department of Thyroid and Breast Surgery，Affiliated
4、Hospital of Inner Mongolia Medical University，Hohhot，Inner Mongolia 010050，China【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of linalool on the proliferation and apoptosis of breast cancer MCF7 cells and its related mechanisms.MethodsHuman breast cancer MCF7 cells were treated with different concen
5、trations of lindenyl（0 mol/L，5 mol/L，10 mol/L，and 20 mol/L，respectively）.Cell migration wasdetected by scratch assay，cell invasion ability was detected by Transwell method，flow cytometry was used to detectapoptosis，and Western blotting was used to detect the expression of TGF1/Foxp3/RORt signaling p
6、athwayrelated proteins.ResultsAfter the cells were treated with linalool，the cells in the linalool（5 mol/L，10 mol/L，and 20 mol/L）group had a significantly reduced healing rate and invasion ability compared to those in the controlgroup（P0.01 or P0.05）.And with the increase of linalool concentration，t
7、he scratch healing rate and invasion ability of cells gradually decreased，and the difference was statistically significant（P0.05）.Compared with the controlgroup，the linalool（5 mol/L，10 mol/L，and 20 mol/L）group cells had a significantly higher apoptotic rate（P0.01 or P0.05）.And with the increase of l
8、inalool concentration，the apoptosis rate gradually increased，the difference was statistically significant（P0.05）.Compared with the control group，the linalool（5 mol/L，10 mol/L，and 20 mol/L）groups significantly reduced the expression of TGF1，Foxp3，and RORt proteins（P0.01 or P0.05）.With the increase of
9、 linalool，the TGF 1，Foxp3，and RORt protein expression levels gradually decreased，and the difference was statistically significant（P0.05）.ConclusionLinalool can regulate the invasion，migration and apoptosis of breast cancer cells by inhibiting the TGF1/Foxp3/RORt signaling pathway in breastcancer cel
10、ls，and has potential targets for breast cancer immunotherapy.【Key words】Linalool；Breast cancer；MCF7 cells；Apoptosis；TGF1/Foxp3/RORt pathway论著桧木醇通过TGF1/Foxp3/RORt通路抑制乳腺癌细胞侵袭、迁移及凋亡的影响祝志川1，张喜平21内蒙古医科大学附属医院普外科，内蒙古呼和浩特 010050；内蒙古2内蒙古医科大学附属医院甲乳外科，呼和浩特 01005046解剖学研究2023年第45卷第1期Anat Res,2023,Vol.45,No.1作为女性
11、最常见得肿瘤，尽管乳腺癌死亡率呈逐渐下降得趋势，但其仍是女性癌症死亡最常见的原因之一1。目前关于乳腺癌的发生发展机制仍不清楚。而乳腺癌的治疗措施主要包括手术治疗、放疗以及化疗等综合治疗的措施，虽然取得了一定的进展，但其预后仍然不理想23。近年来，研究发现中草药，特别是植物挥发油在治疗癌症方面具有很大优势4。桧木醇是提取自台湾扁柏的一种单贴类化合物，是扁柏精油的主要活性成分，具有抗菌和抗肿瘤的活性5。瞿小玲等6发现桧木醇可诱导卵巢癌 SKOV3 细胞凋亡。然而，桧木醇对乳腺癌细胞影响的报道却十分有限。因此，本文以乳腺癌MCF7细胞为研究对象，探讨桧木醇对乳腺癌细胞凋亡的影响及其作用机制，从而为乳
12、腺癌的治疗提供新的潜在药物。1材料与方法1.1材料1.1.1细胞人乳腺癌 MCF7 细胞（上海生命科学院细胞库）。1.1.2药品与试剂桧木醇（美国 Sigma，纯度99%），FBS 胎牛血清、DMEM 培养基（美国 Gibco），TGF 1、Foxp3、维甲酸相关核受体（Orphannuclearreceptor，RORt）抗体（美国 Abcam 公司）；C6流式细胞仪（美国BD 公司），等。1.2方法1.2.1细胞培养将人乳腺癌 MCF7 细胞置于含10%FBS的DMEM培养基中，于37和5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，培养过程中每隔24 d换液一次。1.2.2细胞分组及处理取对数生长期
13、MCF7 细胞，采用 25%胰蛋白酶消化，并用完全培养基打散，并以3104个/ml的密度接种在培养板中，随机分为对照组和 5、10、20 mol/L 桧木醇组，每组至少有 3 个复合孔。培养 24 h 后，分别用 0、5、10 和20 mol/L桧木醇处理细胞。1.2.3采用划痕法检测细胞的迁移取 1.2.2 中处理后的细胞，接种在6孔培养板上，当细胞生长到80%时，使用中等枪头进行垂直水平划线，采用磷酸盐缓冲溶液（PBS）反复洗涤 3 次，37及 5%CO2培养箱中培养，24 h后取出拍照。1.2.4用 Transwell 法检测细胞的侵袭能力向Transwell 小室中加入50 l基质胶，
14、并在37下凝固3 h，将无血清培养基和完全培养基分别添加至上室和下室。将 1.2.2 分组和处理的细胞接种到Transwell 小室的上室，待培养48 h后，将未通过膜的细胞擦除，将剩余细胞用多聚甲醛固定，并用1%结晶紫染色。在显微镜下，将图像放大 200 倍以计算每个区域的侵袭细胞数。1.2.5采用流式细胞技术检测细胞凋亡情况取1.2.2 中培养 48 h 后的细胞，用磷酸盐缓冲溶液（PBS）洗涤 3 次，离心并收集 1105个细胞，用 100L 结合缓冲液使细胞重悬，向细胞悬液中加入 5L Annexin VFITC 和 PI，并在避光条件下反应 15分钟。然后加入 400 L 结合缓冲液
15、，并在 1 h 内通过流式细胞技术检测各组细胞凋亡率。1.2.6采用蛋白免疫印迹法检测 TGF1/Foxp3/RORt信号通路相关蛋白的表达采经1.2.2处理的细胞用RIPA裂解液裂解，提取全蛋白。采用用BCA 试剂盒对蛋白样品进行定量分析，每组收集总蛋白 30 ng，通过 SDSPAGE 凝胶电泳分离总蛋白。电泳后，将蛋白质转移到甲醇预活化的PVDF膜上。封闭后分别孵育多克隆兔抗Klotho、TGF1、Foxp3、RORt、GAPDH 一抗（1 1000），4孵育过夜，用 TBST 冲洗 3 次，每次 5 min。用 HRP（15000）标记羊抗兔 IgG 二体（15000），室温孵育2 h
16、，并用TBST洗涤3次。加入1 ml ECL化学发光试剂，曝光目的蛋白条带，用QuntityOne软件分析目的蛋白相对表达水平。1.3统计学分析应用 SPSS13.0 统计软件进行相关数据分析，计数资料用均值标准差（MeanSD）表示，两组间差异的比较采用 t 检验，多组间比较采用素方差分析，两两比较采用LSDt法。P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1桧木醇对乳腺癌细胞迁移的影响如图1所示，5、10和20 mol/L 桧木醇组细胞与对照组比较，细胞划痕愈合率显著降低（P0.01或 P0.05），且随着桧木醇浓度的升高，细胞划痕愈合率逐渐下降，差异有统计学意义（P0.05）。说明桧木醇对乳腺癌细胞的迁移能力具有一定抑制作用。2.2桧木醇对乳腺癌细胞侵袭能力的影响如图2所示，5、10和20 mol/L 桧木醇组细胞47解剖学研究2023年第45卷第1期Anat Res,2023,Vol.45,No.1与对照组比较，细胞侵袭能力显著降低（P0.01或 P0.05），且随着桧木醇浓度的升高，细胞侵袭能力逐渐下降，差异有统计学意义（P0.05）。说明桧木醇对乳腺癌细胞的侵袭能力具有一定抑制
