1、中 国 组 织 化 学 与 细 胞 化 学 杂 志CHINESE JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY AND CYTOCHEMISTRY第 31 卷第 6 期2022 年 12 月Vol.31.No.6December.2022收稿日期2022-04-10 修回日期2022-12-06基金项目甘肃省高等学校创新基金项目（gzfy-2020-1 6）；甘肃省科技厅科技计划重点研发项目（21YF5A017）作者简介孙东亮，男（1983 年），汉族，在读研究生*通讯作者(To whom correspondence should be addressed)：骨重建逆转期细胞事件及偶联
2、因子再归类孙东亮1，董万涛2*，李兴勇3（1甘肃中医药大学，兰州 730030；2甘肃中医药大学附属医院，兰州 730030；3甘肃省人民医院，兰州 730030）摘要骨重建是由基本多细胞单位（basic multicellular units,BMUs）进行的维持骨体积、微观结构的细胞活动，包括三个在时间和空间上高度协调的过程：骨吸收期、逆转期和骨形成期。BMUs 逆转期发生的细胞事件在时间上是吸收期与形成期的短暂连接，在功能上偶联骨吸收的关闭和骨形成的启动，是骨质疏松症等疾病发生的病理生理基础。依据骨重建模型重新归类逆转期纷繁复杂的细胞分泌或基质偶联因子，可为骨重建障碍的疾病如骨质疏松等，
3、提供符合偶联规律的药物治疗周期和靶点。关键词骨重建；逆转期模型；细胞事件；偶联因子中图分类号R329.4 文献标识码A DOI：10.16705/ki.1004-1850.2022.06.013Reclassification of cellular events and related coupling factors in the reverse phase of bone remodelingSun Dongliang1,Dong Wantao2*,Li Xingyong3(1Gansu University of Chinese Medicine,Lanzhou 730030,Chin
4、a;2Affiliated Hospital of Gansu University of traditional Medicine,Lanzhou 730030,China;3Gansu provincial Peoples Hospital,Lanzhou 730030,China)AbstractBone remodeling is a cellular activity carried out by basic multicellular units(BMUs)to maintain bone volume and microstructure.It includes three hi
5、ghly coordinated processes in aspect of time and space:bone resorption stage,reversal stage and bone formation stage.The cellular events in the reversal phase of BMUs are the short connection between the absorption phase and the formation phase in time,and are functionally coupled with the closure o
6、f bone absorption and the initiation of bone formation,which is the pathophysiological basis for diseases such as osteoporosis.Reclassifying the complex cell secretion or matrix coupling factors in the reversal phase according to the bone remodeling model can provide drug treatment cycles and target
7、s in line with the coupling law for diseases with bone remodeling disorders,such as osteoporosis.KeywordsBone reconstruction;reversal period model;cellular events;coupling factor骨骼的完整性由不断重复的骨吸收和骨形成过程维持，称为骨重建。基本多细胞单位（basic multi-cellular units,BMUs）是偶联吸收和形成这两种不可分割活动的微观结构。骨重建失衡学说1是目前被广泛接受的骨质疏松发病理论，其认为
8、骨形成-吸收平衡被打破，吸收大于形成从而导致骨质减少及强度下降，但是这种理论忽略了骨吸收与形成间的偶联关系。例如双膦酸盐和地诺单抗等抗吸收药，由于偶联作用同时损害骨形成，因此增大发生长期不良事件的可能性2。间歇性甲状旁腺激素（parathyroid hormone,PTH）等骨形成药物以及 PTH 相关蛋白疗法也会刺激骨吸收，使其在使用两年后合成代谢作用不足3。因此了解偶联机制对于抗骨质疏松药物的作用模式及其局限性尤为重要。最近在人体样本上进行的 BMUs 偶联现象的实时可视化模型4，明确了逆转期的存在和其中发生的细胞事件。逆转细胞通过在骨重建部位产生成骨环境，成为破骨细胞与成骨细胞偶联的中介
9、，并通过表型转换将骨吸收逆转为骨形成。这一过程包括3个在时间和空间上有序的细胞事件：骨吸收期，逆转中国组织化学与细胞化学杂志618第 31 卷细胞激活、增殖、表型转换的逆转期及骨形成期。细胞分泌或基质偶联因子在特定位置和时间精细地相互作用，是实现骨重建偶联过程的关键环节，对维持骨骼稳态至关重要，本文依据骨重建模型重新归类逆转期出现的偶联因子，为寻找符合偶联规律的药物靶点提供广阔前景。1 逆转细胞的性质逆转细胞是成骨细胞前体或谱系细胞，来源于骨髓间充质干细胞，是处于不同分化、增殖、迁移阶段的骨祖细胞，可逐渐分化为成骨细胞5。在电子显微镜下，观察到破骨细胞附近的早期逆转细胞位于破骨细胞下方，并与破
10、骨细胞的质膜发生直接接触。因此它们理想地暴露于破骨细胞释放的偶联因子中6。早期逆转细胞表现为促吸收表型，分泌基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）7，这些 MMPs 有助于破骨细胞打开矿化骨基质的通道和降解上层非矿化胶原蛋白。此外，逆转细胞产生核因子-B 受体活化因子配体（receptor activator of NF-B ligand,RANKL）8，这是早期成骨细胞的典型细胞因子，这种 RANKL 在几个调节水平上促进破骨细胞的吸收9。分化晚期逆转细胞囊泡很少，成为成熟成骨细胞，表型转化为促合成型，产生多种细胞因子如骨保护素（osteoproteg
11、erin,OPG）等，抑制破骨细胞增殖分化促进其凋亡，在成人骨重建中发挥作用10。2 基本多细胞单位及骨重建模型骨重建的过程是由基本多细胞单位（BMUs）实现的，是进行骨形成-吸收的微观功能单位，包含破骨细胞、成骨细胞和逆转细胞的功能性细胞团簇11，其诱导形成的骨质吸收和形成发生在骨表面，哈弗氏管内皮质表面、髓腔内表面和骨小梁表面12。2.1 基于基本多细胞单位的骨重建模型利用骨皮质内哈弗氏 BMUs 的方向平行于长骨干长轴的特点，研究 9 名（平均年龄 13.9 岁）接受髋关节矫正手术的患者股骨样本，以及 10 名成年人（平均年龄 55.4 岁）的腓骨样本，对具有重建活性的哈弗氏系统的表面，
12、切取 2060 个相邻的 3.5 m 厚的纵向切片；用抗酒石酸抗性酸性磷酸酶（TRACP）或组织蛋白酶 K（CatK）免疫组织化学染色，以标示破骨细胞的位置及数量；原位杂交技术检测碱性磷酸酶、Runt 相关转录因子 2 和 III 型胶原的表达，以标示骨祖细胞的位置及数量；对这些组合信息三维重建后获得连续、完整、自然的单个 BMUs 骨重建模型4。该模型类似于一个锥型隧道，基于细胞事件可划分为以下 3 个阶段。骨吸收期：大量破骨细胞紧密排列在锥型隧道顶端，被定义为原发破骨细胞，这种启动骨重建周期的原发破骨细胞主要促进沿隧道轴线的初始吸收。逆转期：在原发破骨细胞迁移后的吸收轨迹附近，出现大量逆转
13、细胞定植，而伴随逆转细胞出现的是在锥形隧道壁上增殖的破骨细胞，称为继发破骨细胞，其作用为促进锥型隧道直径加宽的再吸收。继发破骨细胞与逆转细胞混合存在直到骨形成期开始，这种细胞混合的骨表面被称为逆转再吸收表面。三维重建后使用直径来计算初始吸收期末和逆转再吸收期末达到的隧道横截面积，再吸收期的吸收量平均为全部骨总吸收量的 83%以上，说明逆转期骨吸收量是重建周期整体吸收的主要贡献者。沿着逆转期的纵轴的细胞定量显示，破骨细胞密度沿着纵轴随时间逐渐减少，在骨形成期开始时，其几乎完全消失。而逆转细胞的密度随时间逐渐增加，在增殖到每毫米 39 个细胞这个阈值时，骨形成期开始。比较多个 BMUs 发现逆转细
14、胞的募集越慢，骨形成的启动越晚，再吸收区域的长度越长直径越宽，在骨重建周期中产生的暂时性骨缺损就越高。逆转细胞募集率是启动骨合成和关闭骨吸收的关键。对 35名女性（年龄 17 78 岁）进行的分析表明，延迟偶联或解偶联造成的再吸收区域的加长和增宽，对年龄导致的骨丢失的贡献最大13。骨形成期：由大量靠近类骨质的逆转细胞增殖、分化后形成的成熟成骨细胞构成，可以产生类骨质和矿物质沉积，周围不存在破骨细胞。利用该模型，能够获得从最初的吸收事件到骨沉积开始的整个细胞事件的真实图像，BMUs 作为一个功能连续体揭示了：骨基质经历多个吸收阶段，逆转期越来越多的逆转细胞被招募，一旦达到阈值细胞密度，就启动骨形
15、成并关闭骨吸收。2.2 基于基本多细胞单位局部细胞的重建模型BMUs 局部细胞包含具有相邻关系的骨衬细胞、骨髓被膜/冠层细胞、骨髓毛细血管周细胞。骨衬细胞（bone-lining cells,BLC）是预先存在于静止骨表面的细胞，相关研究14已经确认BLC来源的逆孙东亮等.骨重建逆转期细胞事件及偶联因子再归类第 6 期 619转细胞，是成人正常骨转换过程中的骨祖细胞。骨髓被膜（bone marrow envelope,BME）即红骨髓周围的一层间充质干细胞，其覆盖在 BLC 上称为冠层细胞。免疫组织化学和原位杂交显示BME表达早期成骨细胞谱系标志，如平滑肌肌动蛋白（smooth muscle
16、actin,SMA）15；此外它们分泌 RANKL 等早期成骨细胞系的典型因子9。相关研究16表明作为骨祖细胞储存库的BME的破坏，与绝经后或糖皮质激素诱导的骨质疏松症的骨丢失相关。与BME临近的骨髓毛细血管也是逆转细胞的来源之一。这些毛细血管与 H 型血管（一种骨特异性微血管亚型）或过渡血管相同，后者在小鼠模型中被广泛研究与骨形成的关系，这些毛细血管也可能是骨祖细胞循环至骨重建部位的通道17。骨形成减少的情况是否可能与毛细血管的缺陷有关还有待研究，但在 H 血管缺失的小鼠长骨中，骨骼生长停止。在皮质骨移植模型中，骨髓毛细血管周细胞从生态位通过跨皮质血管迁移至骨重建部位，并促进新的成骨细胞形成和骨管闭合18。基于股骨皮质内多个 BMUs 连续切片，按时间顺序进行三维重建后，得到破骨细胞侵蚀骨表面，激活逆转细胞引起局部变化的时间模型19-22：在垂直于骨表面的横截面上，单个破骨细胞在向左移动时侵蚀骨表面，随时间间隔不同的逆转细胞变化。第一阶段：破骨细胞接近骨表面静止的 BLC 和处于休眠状态的 BME，随着破骨细胞的移动，BLC 发生收缩而 BME 会被抬高，两者同时被激活；第二阶段：破
