1、书 书 书中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准犌犅 食品安全国家标准食品微生物学检验唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（椰毒假单胞菌酵米面亚种）检验 发布 实施中华人民共和国国家卫生健康委员会国 家 市 场 监 督 管 理 总 局发 布书 书 书犌犅 前言本标准代替 食品卫生微生物学检验椰毒假单胞菌酵米面亚种检验。本标准与 相比，主要变化如下：标准名称修改为“食品安全国家标准食品微生物学检验唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（椰毒假单胞菌酵米面亚种）检验”；修改了范围；修改了设备和材料；修改了培养基和试剂；修改了检验程序；增加了结果报告；增加了附录。犌犅 食品安全国家标准食品微生物学检验唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（椰毒假
2、单胞菌酵米面亚种）检验范围本标准规定了食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（椰毒假单胞菌酵米面亚种）犅狌 狉 犽 犺 狅 犾 犱 犲 狉 犻 犪犵 犾 犪犱 犻 狅 犾 犻（犘狊 犲 狌犱 狅犿狅 狀 犪 狊犮 狅 犮 狅 狏 犲 狀 犲 狀 犪 狀 狊 犳犪 狉 犻 狀 狅 犳 犲 狉犿犲 狀 狋 犪 狀 狊）的检验方法。本标准适用于食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（椰毒假单胞菌酵米面亚种）的检验。设备和材料 实验室常规灭菌设备。冰箱：、。恒温培养箱：、。恒温水浴锅：。显微镜：倍 倍。均质器。离心机：。电子天平：感量。比浊计。锥形瓶：容量 、。无菌培养皿：直径、直径 。无菌透明玻璃纸、滤纸。无菌灌胃器：。微
3、生物生化鉴定系统。小鼠：，每一批次试验应使用同一品系的或 小鼠。培养基和试剂 增菌液：见。改良马铃薯葡萄糖琼脂（）：见。马铃薯葡萄糖琼脂（）：见 。培养基：见。马铃薯葡萄糖半固体琼脂：见。卵黄琼脂：见。革兰氏染色液：见。氧化酶试剂：见。犌犅 培养基（试验用）：见。蛋白胨水（靛基质试验用）：见。缓冲葡萄糖蛋白胨水（和 试验用）：见 。西蒙氏柠檬酸盐培养基：见 。苯丙氨酸培养基：见 。糖发酵管：见 。半固体琼脂：见 。抗多价血清、型特异性因子血清（、）。生化鉴定试剂盒。检验程序唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（椰毒假单胞菌酵米面亚种）检验程序见图。图唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（椰毒假单胞菌酵米面亚种）检验程序犌犅
4、操作步骤 样品处理无菌操作称取（）样品，置入盛有 增菌液的无菌均质袋中（鲜银耳样品取，用剪刀剪碎，加入盛有 增菌液的无菌均质袋中），用拍击式均质器拍打 ；或置入盛有 增菌液的无菌均质杯中，以 均质 ；若样品为液态，振荡混匀。增菌将上述样品增菌液置 培养 。分离用直径的接种环取增菌液一环，分别划线接种于平板和平板，培养 。观察各个平板上生长的菌落，各个平板上菌落特征见表。表唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（椰毒假单胞菌酵米面亚种）在不同分离平板上的菌落特征培养基菌落特征平板培养 后，菌落，紫色，光滑、湿润、边缘整齐；培养 后，部分菌落中心可有呈草帽状凸起平板培养 后，菌落，灰白色，光滑、湿润、边缘整齐卵黄琼
5、脂平板培养 后，菌落，表面光滑、湿润；培养 后，菌落周围形成乳白色混浊环，斜射光下可见菌落及周围培养基表面呈虹彩现象 初筛试验自选择性琼脂平板上分别挑取个以上典型或可疑菌落（低于个全选），分区划线接种于卵黄琼脂平板，培养。挑取培养 的菌落进行革兰氏染色及氧化酶试验。对于革兰氏染色阴性、氧化酶试验阴性的菌继续培养至，对于卵磷脂酶阳性，带有虹彩环的单个菌落，接种平板，培养。生化试验从纯培养的平板上挑取菌苔进行生化鉴定。唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（椰毒假单胞菌酵米面亚种）生化特征见表。可选择生化鉴定试剂盒或微生物生化鉴定系统。表唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（椰毒假单胞菌酵米面亚种）生化特征生化试验特征试验（氧化型
6、）氧化葡萄糖犌犅 表（续）生化试验特征果糖木糖半乳糖蔗糖阿拉伯糖甘露醇侧金盏花醇肌醇卫茅醇动力卵磷脂酶氧化酶尿素明胶液化硝酸盐还原柠檬酸盐利用精氨酸石蕊牛乳靛基质 苯丙氨酸脱氨酶产生注：表示阳性；表示阴性。血清学分型（可选择项）菌体抗原的制备将平板 培养 的培养物用无菌生理盐水洗下，沸水浴（），离心弃上清液，再用无菌生理盐水稀释至 菌悬液，作为凝集试验用抗原。菌体抗原的鉴定用多价血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。与多价血清凝集者，依次用、因子血清做试管凝集试验。根据试验结果，判定菌体抗原型。在生理盐水中自凝者不能分型。生化特征符合，但不能与以上血清凝集者，需保留菌株做进一步鉴定。犌犅
7、毒性试验 产毒培养将初步鉴定为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（椰毒假单胞菌酵米面亚种）的菌株接种平板，培养，用灭菌接种环刮取适量菌苔，加到无菌生理盐水的试管中，配成麦氏浓度（，）的菌悬液（约为），用无菌吸管吸取，滴在铺好无菌玻璃纸的直径 马铃薯葡萄糖半固体平板上，用无菌棒涂布均匀，培养。取下带菌的玻璃纸，将半固体平板置于 流动蒸汽灭菌 。室温冷却后，置 冰箱过夜。将冰冻好的半固体平板置室温融化，用无菌吸管吸出冻融液，经滤纸过滤至无菌试管或锥形瓶中（此为毒素粗提液），避光保存。同时，将未接种菌苔、铺好无菌玻璃纸的直径 马铃薯葡萄糖半固体平板作为阴性对照，按照同样的试验方法制备阴性对照粗提液，避光保存。毒力
8、测定取毒素粗提液或经 水浴蒸发后的倍 倍浓缩液，灌胃小鼠只，每只，观察至。若菌株产生米酵菌酸，小鼠在灌胃后 内发病。主要症状为竖毛、萎糜不振、躁动，继而行步蹒跚、肢体麻痹、瘫软、抽搐，呈角弓反张状，呼吸急促、死亡。取阴性对照粗提液或经 水浴蒸发后的倍 倍浓缩液，灌胃小鼠只，每只，观察至。小鼠应健康存活。米酵菌酸测定毒力测定实验阳性时，分别取毒素粗提液，阴性对照粗提液，按照 执行。结果报告生化试验符合且毒性试验阳性，报告检出唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（椰毒假单胞菌酵米面亚种）；生化试验和毒性试验有一项不符合，报告未检出唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（椰毒假单胞菌酵米面亚种）。犌犅 附录犃培养基和试剂犃 犌犞犆增
9、菌液犃 马铃薯葡萄糖水（犘犇水）犃 成分马铃薯（去皮）葡萄糖 蒸馏水 犃 制法称取 去皮马铃薯，切碎块，加 蒸馏水，煮沸 。用纱布过滤，补加蒸馏水至 。加入葡萄糖，加热溶化，分装，高压 。犃 龙胆紫水溶液犃 成分龙胆紫 蒸馏水 犃 制法取 龙胆紫，用少量蒸馏水溶解后，加蒸馏水，稀释到 ，保存在棕色瓶内。使用前过滤除菌。犃 氯霉素溶液犃 成分氯霉素 蒸馏水 犃 制法 氯霉素溶解于 蒸馏水，过滤除菌。犃 犌犞犆增菌液每 水中加入龙胆紫水溶液、氯霉素溶液，混匀，分装后置于备用。混合液中龙胆紫和氯霉素的终浓度分别为 和。犌犅 犃 改良马铃薯葡萄糖琼脂（犕狅 犱 犻 犳 犻 犲 犱犘 狅 狋 犪 狋 狅
10、犇犲 狓 狋 狉 狅 狊 犲犃犵 犪 狉，犿犘犇犃）犃 马铃薯葡萄糖琼脂（犘犇犃）犃 成分马铃薯（去皮）葡萄糖 琼脂 蒸馏水 犃 制法称取 去皮马铃薯，切碎块，加 蒸馏水，煮沸 。用纱布过滤，补加蒸馏水至 。加入葡萄糖和琼脂，加热溶化，分装，高压灭菌 。犃 龙胆紫水溶液犃 成分龙胆紫 蒸馏水 犃 制法取 龙胆紫，用少量蒸馏水溶解后，加蒸馏水，稀释到 ，保存在棕色瓶内。使用前过滤除菌。犃 氯霉素溶液犃 成分氯霉素 蒸馏水 犃 制法 氯霉素溶解于 蒸馏水，过滤除菌。犃 改良马铃薯葡萄糖琼脂（犿犘犇犃）临用时加热溶解琼脂，冷却至，每 中加入龙胆紫水溶液、氯霉素溶液，混匀后倾注平板。龙胆紫和氯霉素的终
11、浓度分别为 和。犃 犘犆犉犃培养基犃 成分 犌犅 胱氨酸 葡萄糖 卫茅醇 琼脂粉 蒸馏水 犃 犘犆犉犃基础培养基制法将上述成分加热溶解后，调节，高压灭菌 ，备用。犃 选择性添加剂硫酸多黏菌素：林肯霉素：犃 制法将基础培养基加热融化冷却至 后，加入选择性添加剂，混匀后倾注无菌平皿中，备用。犃 马铃薯葡萄糖半固体琼脂犃 成分马铃薯（去皮）葡萄糖 琼脂蒸馏水 犃 制法称取 去皮马铃薯，切碎块，加 蒸馏水，煮沸 。用纱布过滤，补加蒸馏水至 。加入葡萄糖和琼脂，加热溶化，分装，高压 。犃 卵黄琼脂犃 基础培养基成分肉浸液 蛋白胨 氯化钠琼脂 犌犅 犃 卵黄盐水悬液犃 卵黄琼脂的制备制备基础培养基，分装每
12、瓶 。高压灭菌 。临用时加热溶化琼脂，冷至，每瓶内加入 葡萄糖水溶液和 卵黄盐水悬液 ，摇匀，倾注平板。犃 革兰氏染色液犃 结晶紫染色液犃 成分结晶紫 乙醇 草酸铵水溶液 犃 制法将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。犃 革兰氏碘液犃 成分碘 碘化钾 蒸馏水 犃 制法将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至 。犃 沙黄复染液犃 成分沙黄 乙醇 蒸馏水 犃 制法将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。犃 染色法犃 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染，水洗。犃 滴加革兰氏碘液，作用，水洗。犃 滴加 乙醇脱色，约 ，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水
13、洗。犃 滴加复染液，复染，水洗、待干、镜检。犌犅 犃 氧化酶试剂犃 成分，四甲基对苯二胺盐酸盐 蒸馏水 犃 制法少量新鲜配制，于冰箱内避光保存，在之内使用。犃 试验方法取单个特征性菌落，涂布在氧化酶试剂湿润的滤纸上。如果滤纸在 之内未变为紫红色、紫色或深蓝色，则为氧化酶试验阴性，否则即为氧化酶实验阳性。注：实验中切勿使用镍铬材料。犃 犎狌 犵 犺 犔 犲 犻 犳 狊 狅 狀培养基（犗犉试验用）犃 成分蛋白胨氯化钠磷酸氢二钾 琼脂葡萄糖 溴麝香草酚蓝溶液 蒸馏水 犃 制法将蛋白胨和盐类加水溶解后，校正至 。加入葡萄糖、琼脂煮沸，溶化琼脂，然后加入指示剂。混匀后，分装试管，高压 ，直立凝固备用。犃
14、 试验方法从斜面上挑取小量培养物作穿刺接种，同时接种两管培养基，其中一管于接种后滴加溶化的液体石蜡于表面（高度约），培养。犃 结果见表。表犃 犗犉试验结果反应类型封口的培养基开口的培养基发酵型（）产酸产酸犌犅 表犃（续）反应类型封口的培养基开口的培养基氧化型（）不变产酸产碱型（）不变不变犃 蛋白胨水（靛基质试验用）犃 成分蛋白胨（或胰蛋白胨）氯化钠蒸馏水 犃 制法按上述成分配制，分装小试管，高压 。犃 靛基质试剂犃 柯凡克试剂：将对二甲氨基甲醛溶解于 戊醇中，然后缓慢加入浓盐酸。犃 欧波试剂：将对二甲氨基苯甲醛溶解于 乙醇内。然后缓慢加入浓盐酸。犃 试验方法挑取小量培养物接种，在 培养，必要时
15、可培养。加入柯凡克试剂约，轻摇试管，阳性者于试剂层呈深红色；或加入欧波试剂约，沿管壁流下，覆盖于培养液表面，阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。注：蛋白胨中应含有丰富的色氯酸。每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后方可使用。犃 缓冲葡萄糖蛋白胨水（犕犚和犞 犘试验用）犃 成分磷酸氢二钾多价胨葡萄糖蒸馏水 犃 制法溶化后校正，分装试管，每管，高压 。犌犅 犃 甲基红（犕犚）试验犃 甲基红试剂犃 成分甲基红 乙醇 蒸馏水 犃 制法 甲基红溶于 乙醇中，然后加入 蒸馏水。犃 试验方法取适量琼脂培养物接种于本培养基，培养。滴加甲基红试剂一滴，立即观察结果。鲜红色为阳性，黄色为阴性。犃 犞 犘试验犃 萘酚乙醇
16、溶液成分及制法：取萘酚，加无水乙醇溶解，定容至 。犃 氢氧化钾溶液成分及制法：取氢氧化钾，加蒸馏水溶解，定容至 。犃 试验方法取适量琼脂培养物接种于本培养基，培养。加入 萘酚乙醇溶液 和 氢氧化钾溶液，充分振摇试管，观察结果。阳性反应立刻或于数分钟内出现红色，如为阴性，应放在 继续培养再进行观察。犃 西蒙氏柠檬酸盐培养基犃 成分氯化钠硫酸镁（）磷酸二氢铵磷酸氢二钾柠檬酸钠琼脂 蒸馏水 溴麝香草酚蓝溶液 犌犅 犃 制法先将盐类溶解于水内，校正，再加琼脂，加热溶化。然后加入指示剂，混合均匀后分装试管，高压 。制成斜面。犃 试验方法挑取少量琼脂培养物接种，培养，每天观察结果。阳性者斜面上有菌落生长，培养基由绿色转为蓝色。犃 苯丙氨酸培养基犃 成分酵母浸膏 苯丙氨酸（或 苯丙氨酸）磷酸氢二钠氯化钠琼脂 蒸馏水 犃 制法加热溶解后分装试管，高压 ，制成斜面。犃 试验方法自琼脂斜面上挑取大量培养物，移种于苯丙氨酸琼脂，培养或 。滴加 三氯化铁溶液滴滴，自斜面培养物上流下，苯丙氨酸脱氨酶阳性者呈深绿色。犃 糖发酵管犃 成分牛肉膏蛋白胨 氯化钠磷酸氢二钠（）溴麝香草酚蓝溶液 蒸馏水 犃 制法葡萄糖发酵
