1、I C S6 7.0 5 0C C S X0 4中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T5 4 4 12 0 2 2出口水产品中三卡因、苯佐卡因、喹哪啶残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法D e t e r m i n a t i o n o f T r i c a i n e,B e n z o c a i n e a n d Q u i n a l d i n e r e s i d u e s i n a q u a t i cp r o d u c t s f o r e x p o r tH P L C/M S/M S m e t h o d2 0 2 2-0 3-1 4发布2
2、 0 2 2-1 0-0 1实施中华人民共和国海关总署发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准前 言 本文件按照G B/T 1.12 0 2 0 标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中华人民共和国厦门海关技术中心、福建省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所、长春海关技术中心、厦门标普标准化服务有限公司。本文件主要起草人:郑向华、孙婷、康明芹、徐敦明、严丽娟、陈燕、林立毅、林建忠、张志刚、傅建炜、陈智勇。S N/T5 4 4 1
3、2 0 2 2以正式出版文本为准以正式出版文本为准出口水产品中三卡因、苯佐卡因、喹哪啶残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法1 范围本文件规定了出口水产品中三卡因、苯佐卡因、喹哪啶残留量的液相色谱-质谱/质谱测定方法。本文件适用于鱼、虾、蟹、贝类、牛蛙等水产品可食组织中三卡因、苯佐卡因、喹哪啶残留量的检测和确证。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。G B/T 6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法3 术语和定义 本文件没有需
4、要界定的术语和定义。4 方法提要 试样中三卡因、苯佐卡因、喹哪啶残留量用磷酸盐缓冲液-甲醇混合溶液提取,经固相萃取柱净化后,用液相色谱-质谱/质谱仪检测和确证,外标法定量。5 试剂和材料 除特殊说明外,所用试剂均为分析纯,水为符合G B/T 6 6 8 2规定的一级水。5.1 乙腈:色谱纯。5.2 甲醇:色谱纯。5.3 甲酸。5.4 磷酸氢二钠。5.5 柠檬酸。5.6 0.2 m o l/L磷酸氢二钠:准确称取磷酸氢二钠2 8.4 g,用水溶解并定容到1 0 0 0 m L容量瓶中,混匀备用。5.7 0.1 m o l/L柠檬酸:准确称取柠檬酸1 9.2 1 g,用水溶解并定容到1 0 0 0
5、 m L容量瓶中,混匀备用。5.8 0.1%甲酸溶液:准确吸取1 m L甲酸(5.3)于1 0 0 0 m L容量瓶中,加水定容至刻度线,混匀备用。5.9 磷酸盐-柠檬酸缓冲液:量取磷酸氢二钠溶液(5.6)4 3 7 m L和柠檬酸溶液(5.7)5 6 3 m L混匀,现配现用。5.1 0 7.5%甲醇溶液:量取7.5 m L 甲醇(5.2)于1 0 0 m L容量瓶中,加水定容至刻度线,混匀备用。1S N/T5 4 4 12 0 2 2以正式出版文本为准5.1 1 磷酸盐缓冲溶液-甲醇混合溶液(5 0+5 0,体积比):量取磷酸盐-柠檬酸缓冲液(5.9)1 0 0 m L和甲醇1 0 0 m
6、 L,混匀备用。5.1 2 标准物质:三卡因(C1 0H1 5NO5S,C A S号:8 8 6-8 6-2)、苯佐卡因(C9H1 1NO2,C A S号:9 4-0 9-7)、喹哪啶(C1 0H9N,C A S号:9 1-6 3-4),纯度均大于等于9 9.0%。5.1 3 标 准 储 备 液:分 别 准 确 称 取 适 量 的 三 卡 因、苯 佐 卡 因、喹 哪 啶 标 准 物 质,用 甲 醇 配 制 成1 0 0 0 m g/L的标准储备液,-1 8 下避光保存,有效期6个月。5.1 4 混合标准工作液的配制:吸取适量标准储备溶液(5.1 3),用甲醇稀释配制成1 0.0 m g/L的混
7、合标准溶液,4 下避光保存,有效期1个月。5.1 5 基质空白溶液:将不同基质的阴性空白样品分别按照8.1和8.2净化处理后得到的溶液。5.1 6 基质混合标准工作溶液:根据需要,吸取适量的混合标准工作液(5.1 4),用基质空白液(5.1 5)稀释至浓度为2 n g/m L、5 n g/m L、1 0 n g/m L、5 0 n g/m L、1 0 0 n g/m L的标准系列溶液,使用前配制。5.1 7 HL B固相萃取柱(固定相:N-乙烯吡咯烷酮和二乙烯基苯共聚物):5 0 0 m g,6 m L或相当者。使用前依次用6 m L甲醇,6 m L磷酸盐-柠檬酸缓冲液(5.9)活化。5.1
8、8 微孔滤膜:0.2 2 m,有机相型。6 仪器与设备6.1 液相色谱串联四极杆质谱仪:配电喷雾正离子源(E S I+)。6.2 分析天平:感量0.1 m g和0.0 1 g。6.3 组织捣碎机。6.4 旋涡混合器。6.5 均质器。6.6 离心机:转速不低于5 0 0 0 r/m i n。6.7 冷冻离心机:转速不低于1 5 0 0 0 r/m i n。6.8 氮吹浓缩仪。6.9 离心管:5 0 m L聚丙烯离心管。6.1 0 固相萃取装置。7 试样的制备与保存7.1 试样制备 取代表性样品约5 0 0 g,将其可食部分先切碎,经组织捣碎机充分捣碎均匀加工成浆状,混匀,装入洁净容器内,密封并注
9、明标记。制样操作过程中应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。7.2 试样保存 将试样于-1 8 以下冷冻存放。8 分析步骤8.1 样品提取 称取1 g样品(精确至0.0 1 g)于5 0 m L离心管中(6.9),加入磷酸盐缓冲溶液-甲醇混合溶液2S N/T5 4 4 12 0 2 2以正式出版文本为准(5.1 1)5 m L,均质器高速匀浆3 0 s,均质器刀头用5 m L磷酸盐缓冲溶液-甲醇混合溶液(5.1 1)清洗,将清洗液与匀浆合并,涡旋2 m i n后,样品于5 0 0 0 r/m i n离心3 m i n,上清液转移至另一5 0 m L离心管(6.9)中;在离心管剩余残渣内再加
10、入1 0 m L磷酸盐缓冲溶液-甲醇混合溶液(5.1 1),涡旋2 m i n,5 0 0 0 r/m i n离心5 m i n。将两次提取液合并,混匀,待净化(部分样品脂肪含量较高,上清液有明显絮状物,可于1 5 0 0 0 r/m i n于-1 0 下冷冻离心1 0 m i n,取上清液净化)。8.2 净化 将混合液(8.1)转移至预活化好的固相萃取柱中(5.1 7),上样后,先用6 m L甲醇溶液(5.1 0)分两次淋洗,抽至近干后用6 m L甲醇分3次洗脱,洗脱液收集于1 0 m L玻璃试管中,4 0 下缓慢均匀氮吹浓缩至近干,残渣用乙腈(5.1)定容至1.0 m L。涡旋混匀后,过微
11、孔滤膜(5.1 8),供液相色谱-质谱/质谱仪检测。8.3 测定8.3.1 液相色谱参考条件 液相色谱参考条件如下:a)色谱柱:C1 8柱,1 5 0 mm2.1 mm(内径),3 m,或相当者。b)柱温:3 5。c)流速:3 0 0 L/m i n。d)进样量:2 L。e)流动相及梯度洗脱条件见表1。表1 流动相及梯度洗脱条件时间/m i n0.1%甲酸溶液/%乙腈/%0.0 09 8.02.02.0 09 8.02.02.1 06 0.04 0.06.0 06 0.04 0.06.1 04 0.06 0.01 0.0 04 0.06 0.01 0.1 02.09 8.01 2.0 02.0
12、9 8.01 2.1 09 8.02.01 5.0 09 8.02.03S N/T5 4 4 12 0 2 2以正式出版文本为准8.3.2 质谱参考条件 质谱参考条件如下:a)离子源:电喷雾离子源(E S I)。b)扫描方式:正离子扫描。c)监测方式:多反应监测模式(MRM)。d)其他质谱条件参见附录A。8.3.3 液相色谱-质谱/质谱测定8.3.3.1 定性测定 按照上述色谱和质谱条件下测定样品和基质标准工作溶液,试样中待测物色谱峰保留时间与基质标准工作溶液保留时间相差不超过2.5%,所监测定性离子均出现(S/N3),定性离子对的相对丰度与浓度相当的基质标准工作溶液的相对丰度一致,相对丰度允
13、许偏差不超过表2规定的范围,则可判定样品中存在对应的被测物。表2 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度/%5 02 05 01 02 01 0允许的最大偏差/%2 02 53 05 08.3.3.2 定量测定 在仪器最佳工作条件下,对基质混合标准工作溶液进样,以峰面积为纵坐标,基质混合工作溶液浓度为横坐标绘制标准工作曲线,用标准工作曲线对样品进行定量,样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。如果含量超过标准曲线范围,应稀释到合适浓度后分析。在上述仪器条件下,各分析物的参考保留时间为:喹哪啶3.6 4 m i n,三卡因5.4 9 m i n,苯佐卡因7.4 3 m i
14、n。喹哪啶、三卡因、苯佐卡因标准溶液的多反应监测(MRM)色谱图参见附录B。8.4 空白试验 除不加试样外,均按上述相同条件和步骤进行。9 结果计算与表述 试样中被测物的含量由液相色谱-质谱/质谱仪的数据处理系统计算或按式(1)计算,计算结果需扣除空白值。Xi=ciV1 0 0 0m1 0 0 0(1)式中:Xi 试样中被测组分含量,单位为微克每千克(g/k g);ci 从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度,单位为微克每升(g/L);V 试样溶液定容体积,单位为毫升(m L);m 最终定容体积试样溶液所代表试样的质量,单位为克(g)。4S N/T5 4 4 12 0 2 2以正式出版文本为准1
15、 0 检出限和定量限 本方法三卡因、苯佐卡因、喹哪啶的检出限为2 g/k g,定量限为5g/k g。1 1 回收率 本方法对鱼、虾、蟹、贝类、牛蛙等水产品基质进行添加回收率试验,添加浓度和回收率范围参见附录C。5S N/T5 4 4 12 0 2 2以正式出版文本为准附 录 A(资料性)参考质谱条件1)质谱参考条件:a)离子化模式:E S I+;b)质谱扫描方式:多反应监测(MRM);c)分辨率:单位分辨率;d)雾化气压力(G S 1):3 7 9.2 K p a(氮气);e)辅助气压力(G S 2):3 7 9.2 K p a(氮气);f)喷雾电压(I S):5 5 0 0 V;g)离子化温
16、度(T EM):6 0 0.0;h)碰撞气压力(C A D):4 1.4 K p a(氮气);i)气帘气压力(C UR):1 7 2.4 K p a(氮气);j)其它质谱参数见表A.1。表A.1 主要参考质谱参数组分名称离子对/(m/z)驻留时间/m s去簇电压(D P)/V入口电压(E P)/V碰撞能量(C E)/e V碰撞池出口电压(C X P)/V三卡因1 6 6.1/1 3 8.0*1 6 6.1/9 4.1苯佐卡因1 6 6.1/1 3 8.1*1 6 6.1/9 4.0喹哪啶1 4 4.1/1 2 8.0*1 4 4.1/1 0 3.05 0.06 7.26 8.05 9.35 8.68 0.08 0.01 0.01 9.22 8.92 2.41 4.64 4.93 4.81 5.0 *为定量离子对,对于不同质谱仪器,仪器参数可能存在差异,测定前应将质谱参数优化到最佳。1)非商业性声明:附录A所列参考质谱条件是在A P I 4 0 0 0 p l u s型液质联用仪上完成的,此处列出试验用仪器型号仅为提供参考,并不涉及商业目的,鼓励标准使用者尝试不同厂家或型号的仪器。6S
