1、I C S6 7.0 5 0C C S X0 4中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T4 5 4 5.32 0 2 2 商品化试剂盒检测方法 沙门氏菌 方法三C o mm e r c i a l k i t t e s t m e t h o dS a l m o n e l l aT e s t m e t h o d 2 0 2 2-0 3-1 4发布2 0 2 2-1 0-0 1实施中华人民共和国海关总署发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准前 言 本文件按照G B/T 1.12 0 2 0 标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草。本文件是S N/T
2、 4 5 4 5 商品化试剂盒检测方法 沙门氏菌 的第3部分。S N/T 4 5 4 5已经发布了下列部分:商品化试剂盒检测方法 沙门氏菌 方法一;商品化试剂盒检测方法 沙门氏菌 方法二;商品化试剂盒检测方法 沙门氏菌 方法三。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中华人民共和国福州海关、中华人民共和国长春海关。本文件主要起草人:郑晶、林杰、郭菁、肖颖、徐珊、陈练洪、陈彬、柯璐、柯秋璇、刘阳、丁旭、王玮琳、张温玲、黄常娇、曾维扬。S N/T4 5 4 5.32 0 2 2以正式出版文本为准以正式出版文
3、本为准商品化试剂盒检测方法沙门氏菌 方法三1 范围本文件规定了食品中3 M沙门氏菌分子检测试剂盒的检测方法。本文件适用于食品中沙门氏菌的筛选检测。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。G B 4 7 8 9.4 食品安全国家标准 沙门氏菌检验G B 1 9 4 8 9 实验室 生物安全通用要求G B/T 2 7 4 0 3 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测S N/T 2 7 7 5 商品化食品检测试剂盒评价方法S N/T 3
4、2 6 6 食品微生物检验方法确认技术规范3 术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4 生物安全措施为了保护实验室人员的安全并防止污染,应由具备资格的人员进行操作。所有培养物、D NA提取物和废弃物应按照G B 1 9 4 8 9和G B/T 2 7 4 0 3中的有关规定执行。5 方法提要根据沙门氏菌属特有靶序列上的6个独立区域,通过稳定的 B s t D NA聚合酶在6 0 进行环介导恒温扩增反应,AT P-硫酸化酶将焦磷酸盐(P P i)指数级转化为三磷酸腺苷(AT P),荧光素酶利用AT P生成光,进行实时检测。6 试剂和材料6.1 3 M沙门氏菌分子检测试剂盒(3 M M o l
5、 e c u l a r D e t e c t i o n A s s a y 2-S a l m o n e l l a)参考S N/T 2 7 7 5和S N/T 3 2 6 6对3 M 沙门氏菌分子检测试剂盒进行了评价。具体评价结果参见附录A。试剂盒组成如下:1S N/T4 5 4 5.32 0 2 2以正式出版文本为准a)3 MTM裂解液管;b)3 MTM沙门氏菌试剂管;c)3 MTM试剂对照(R C);d)附加盖。储存于2 8,有效期2 4个月。6.2 缓冲蛋白胨水(B PW)按照附录B.1配制。7 仪器和设备7.1 3 M分子检测分析仪:含快速转移托盘。7.2 移液器:量程1 0
6、 L1 0 0 L。7.3 水浴锅或加热模块:1 0 0 1。7.4 计时器。7.5 恒温培养箱:3 6 1。7.6 电子天平:感量 为0.1 g。8 检测程序3 M沙门氏菌分子检测试剂盒的检测程序见图1。图1 3 M沙门氏菌分子检测试剂盒的检测程序2S N/T4 5 4 5.32 0 2 2以正式出版文本为准9 操作步骤9.1 样品制备、增菌培养 按照G B 4 7 8 9.4标准方法进行样品制备和缓冲蛋白胨水增菌培养。9.2 裂解9.2.1 将裂解液管放置室温(2 0 2 5),1 6 h1 8 h进行回温。9.2.2 打开裂解液管管盖,吸取2 0 L 缓冲蛋白胨水增菌液至裂解液管,1 0
7、 0 1 加热1 5 m i n,室温(2 0 2 5)冷却5 m i n 1 0 m i n,获得溶菌液。9.3 环介导恒温核酸扩增9.3.1 空白对照、阳性对照设置每次反应必须设置空白对照和阳性对照,空白对照以缓冲蛋白胨水替代D NA模板,阳性对照使用试剂盒中的3 MTM试剂对照。9.3.2 反应过程 反应过程操作步骤如下:a)打开3 MTM沙门氏菌试剂管管盖;b)吸取裂解液管液体上部1/2中的2 0 L 溶菌液至3 MTM沙门氏菌试剂管中(含有冻干的试剂小球),盖上附加盖;c)将3 MTM沙门氏菌试剂管装进快速转移托盘,关闭并锁定托盘盖;d)在3 M分子检测分析软件中查看和确认对应的检测
8、,在软件中单击启动按钮,仪器盖自动打开;e)将快速转移托盘放入3 M分子检测分析仪并关闭盖,启动分析;f)扩增6 0 m i n,仪器实时自动报告检测结果。1 0 结果报告1 0.1 空白对照结果为阴性,3 MTM试剂对照结果为阳性时,结果有效:a)若仪器报告阳性结果,则该样品沙门氏菌初筛阳性,须取样品增菌液按G B 4 7 8 9.4进行分离、生化试验和血清学鉴定后报告结果;b)若仪器报告阴性结果,则可报告沙门氏菌未检出。1 0.2 若空白对照结果为阳性或3 MTM试剂对照结果为阴性,则本次检测结果无效,应更换试剂按本方法重新检测。3S N/T4 5 4 5.32 0 2 2以正式出版文本为
9、准附 录 A(资料性)3 M沙门氏菌分子检测试剂盒评价结果1)A.1 包容性和排他性 选择1 0 0株经确认的沙门氏菌标准菌株和分离菌株,用3 M沙门氏菌分子试剂盒方法进行测试,结果全部为阳性。选择3 0株经确认的非沙门氏菌的标准菌株,用3 M沙门氏菌分子试剂盒方法进行测试,结果全部为阴性。A.2 灵敏度、特异性、准确度及检出限 选择5个食品种类,1 5个食品类型的样品,采用人工污染的方式制备试验样品。分别用3 M 沙门氏菌分子试剂盒方法与参考方法进行测试,相对准确度、相对灵敏度、相对特异性及相对检出限见表A.1。表A.1 相对准确度、相对灵敏度、相对特异性和相对检出限食品基质相对准确度/%相
10、对灵敏度/%相对特异性/%相对检出限/(C F U/g)肉类1 0 01 0 01 0 00.1 6鱼类和海产品1 0 01 0 01 0 00.1 6果蔬制品1 0 01 0 01 0 00.2 4乳制品1 0 01 0 01 0 00.2 4杂品1 0 01 0 01 0 00.2 8A.3 耐变性 分别对3个实验条件进行耐变性试验:裂解时间(1 3 m i n,1 7 m i n),裂解体积(1 8 L,2 2 L)和反应体积(1 8 L,2 2 L)。试验结果表明3 M沙门氏菌分子检测试剂盒在各实验条件波动范围内,对检测结果无显著性影响。A.4 批间变异取3个不同批号试剂盒分别对含目标
11、菌和非目标菌样品进行批间变异试验,试验结果表明,3 M 沙门氏菌分子检测试剂盒批间无显著性差异。1)本评价结果仅适用于3M有限公司的沙门氏菌分子检测试剂盒。4S N/T4 5 4 5.32 0 2 2以正式出版文本为准附 录 B(规范性)培养基和试剂B.1 缓冲蛋白胨水(B PW)B.1.1 成分蛋白胨 1 0.0 g氯化钠 5.0 g磷酸氢二钠(N a2H P O41 2 H2O)9.0 g磷酸二氢钾 1.5 g蒸馏水 1 0 0 0 m LB.1.2 制法将各成分加入蒸馏水中,搅混均匀,静置约1 0 m i n,煮沸溶解,调节p H至7.20.2,高压灭菌1 2 1,1 5 m i n。5
12、S N/T4 5 4 5.32 0 2 2以正式出版文本为准以正式出版文本为准以正式出版文本为准220235454T/NS中华人民共和国出入境检验检疫行 业 标 准商品化试剂盒检测方法沙门氏菌 方法三S N/T 4 5 4 5.32 0 2 2*中国海关出版社有限公司出版发行北京市朝阳区东四环南路甲1号(1 0 0 0 2 3)编辑部:(0 1 0)6 5 1 9 4 2 4 2-7 5 3 0网址 w ww.c u s t o m s k b.c o m/b o o k中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本8 8 01 2 3 0 1/1 6 印张0.7 5 字数1 6千字2 0 2 2年 月第一版 2 0 2 2年 月第一次印刷印数 1*书号:1 5 5 1 7 58 0 0定价1 2.0 0元以正式出版文本为准
