1、I C S6 7.0 5 0C C S X0 4中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T5 4 5 02 0 2 2 动物源食品中9种双稠吡咯啶类生物碱的测定 液相色谱-质谱/质谱法D e t e r m i n a t i o n o f 9 p y r r o l i z i d i n e a l k a l o i d s i n a n i m a l-o r i g i n f o o d L i q u i d c h r o m a t o g r a p h y t a n d e m m a s s s p e c t r o m e t r y m e t h o
2、d2 0 2 2-0 3-1 4发布2 0 2 2-1 0-0 1实施中华人民共和国海关总署发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准前 言 本文件按照G B/T 1.12 0 2 0 标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中华人民共和国南京海关、中华人民共和国石家庄海关、中华人民共和国重庆海关、中华人民共和国青岛海关、中华人民共和国杭州海关。本文件主要起草人:丁涛、殷耀、宋卫得、郭思言、张文国、姜珊、季美泉、赵翌龙、马育松、谢文、
3、吴永苹。S N/T5 4 5 02 0 2 2以正式出版文本为准以正式出版文本为准动物源食品中9种双稠吡咯啶类生物碱的测定 液相色谱-质谱/质谱法1 范围 本文件规定了动物源食品中9种双稠吡咯啶类生物碱的液相色谱-质谱/质谱测定方法。本文件适用于蜂蜜、乳及乳制品、畜禽肉(牛、猪、鸡)及其内脏中野百合碱、克氏千里光宁碱、倒千里光碱、千里光菲灵碱、千里光宁、立可沙明碱、天芥菜碱、毛果天芥菜碱、蓝蓟定9种双稠吡咯啶类生物碱残留量的测定。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版
4、本(包括所有的修改单)适用于本文件。G B/T 6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法3 术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4 方法提要蜂蜜样品用0.1 m o l/L盐酸溶液溶解,乳及乳制品用5%三氯乙酸溶液沉淀蛋白,畜禽肉及内脏制品用5%乙酸乙腈溶液提取,混合型强阳离子交换固相萃取柱富集净化,高效液相色谱-质谱/质谱进行测定,外标法定量。5 试剂和材料除另有规定外,所有实验用试剂均为分析纯,水为G B/T 6 6 8 2中规定的一级水。5.1 乙腈。5.2 甲酸。5.3 乙酸。5.4 甲醇:分析纯和色谱纯。5.5 醋酸铵:色谱纯。5.6 浓盐酸(3 6%3 8%)。5.7 浓
5、氨水(2 5%2 8%)。5.8 三氯乙酸。5.9 标准品:野百合碱(C1 6H2 3NO6,C A S号:3 1 5-2 2-0),克氏千里光宁碱(C1 9H2 7NO6,C A S号:2 3 1 8-1 8-5),倒千里光碱(C1 8H2 5NO6,C A S号:4 8 0-5 4-6),千里光菲灵碱(C1 8H2 3NO5,C A S号:4 8 0-8 1-9),千1S N/T5 4 5 02 0 2 2以正式出版文本为准里光宁(C1 8H2 5NO5,C A S号:1 3 0-0 1-8),立可沙明碱(C1 8H2 5NO5,C A S号:1 0 2 8 5-0 7-1),天芥菜碱(C
6、1 6H2 7NO5,C A S号:3 0 3-3 3-3),毛果天芥菜碱(C2 1H3 3NO7,C A S号:3 0 3-3 4-4),蓝蓟定(C2 0H3 1NO7,C A S号:5 2 0-6 8-3),纯度9 5%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。5.1 0 盐酸溶液(0.1 m o l/L):取9 m L浓盐酸(5.6)用水定容至1 0 0 0 m L。5.1 1 5%三氯乙酸溶液:取5 0 g 三氯乙酸(5.8)用水定容至1 0 0 0 m L。5.1 2 5%氨水-甲醇溶液:取5 m L浓氨水(5.7)用分析纯甲醇定容至1 0 0 m L。5.1 3 1%乙酸乙腈溶液
7、:取1 0 m L乙酸(5.3)用分析纯乙腈定容至1 0 0 0 m L。5.1 4 甲醇水溶液:取1 0 m L色谱纯甲醇(5.4),用水定容至1 0 0 m L。5.1 5 混合型强阳离子固相萃取柱(6 0 m g 或相当者):使用前依次用3 m L甲醇、3 m L水、3 m L 0.1 m o l/L 盐酸活化,保持柱体湿润。5.1 6 标准储备液:分别称取9种双稠吡咯啶类生物碱标准品(5.9)各 1 0 m g 于1 0 m L容量瓶中,用色谱纯甲醇(5.4)溶解,配制成 1 m g/m L的标准储备液。再分别准确吸取1 m g/m L的9种单标准储备液,用色谱纯甲醇(5.4)逐级稀释
8、到1 0 g/m L和1g/m L的混合标准溶液,于4 冰箱保存。5.1 7 标准工作溶液:吸取适量1 g/m L标准储备液(5.1 6),用色谱纯甲醇(5.4)释成浓度范围为2 0 n g/m L3 0 0 n g/m L系列标准工作溶液,现配现用。5.1 8 滤膜:有机相、水相 0.2 2 m。5.1 9 定性滤纸。6 主要仪器和设备6.1 液相色谱-串联质谱仪:配备电喷雾离子源(E S I)。6.2 天平:感量为0.1 m g和0.0 1 g。6.3 氮吹仪。6.4 涡旋振荡混合器。6.5 离心机:转速1 2 0 0 0 r/m i n。6.6 固相萃取仪。6.7 具塞离心管:5 0 m
9、 L。6.8 组织绞碎机。7 样品制备与保存取混合均匀蜂蜜、乳及乳制品、畜禽肉及其肝脏代表样品后装入洁净容器内,密封,标明标记,蜂蜜和乳粉于室温避光保存,其他样品于-1 8下保存。8 测定步骤8.1 供试样品提取和净化称取2 g 蜂蜜样品(精确至 0.0 1 g)于5 0 m L带盖聚四氟乙烯离心管中,加入1 0 m L 0.1 m o l/L盐酸(5.1 0),涡旋混合均匀后准备净化。称取5 g 液态乳或2 g乳粉样品(精确至 0.0 1 g)于5 0 m L带盖聚四氟乙烯离心管中,加入1 0 m L 5%三氯乙酸溶液(5.1 1),涡旋1 m i n,超声 2 0 m i n,高速离心后定
10、性滤纸过滤,滤液准备净化。混合型强阳离子固相萃取柱(5.1 5)预先用 3 m L分析纯甲醇和 3 m L 0.1 m o l/L 盐酸活化,将样品溶液以小于1 m L/m i n流速过柱,依次用 3 m L水和 3 m L分析纯甲醇淋洗,加入5 m L 5%氨水-甲醇溶2S N/T5 4 5 02 0 2 2以正式出版文本为准液(5.1 2)洗脱,收集的洗脱液于4 0 下氮气吹干,用 1.0 m L甲醇水(5.1 4)溶液溶解,依次过有机和水相滤膜(5.1 8)后供高效液相色谱串联质谱测定分析测定。准确称取5 g 动物内脏及肉样品于5 0 m L带盖聚四氟乙烯离心管中,加入2 0 m L乙酸
11、乙腈溶液(5.1 3),涡旋后超声 2 0 m i n,高速离心后过定性滤纸,残渣再加入1 5 m L乙酸乙腈溶液(5.1 3)重复提取1次,合并过滤溶液,于4 0 水浴温度下旋转蒸发至干,用 1.0 m L甲醇水(5.1 4)定容,依次过有机和水相滤膜(5.1 8)后供高效液相色谱串联质谱测定分析测定。8.2 测定8.2.1 仪器条件8.2.1.1 液相色谱参考条件液相色谱参考条件如下:a)色谱柱:E p i c C1 8M S 4.6 mm(内径)1 5 0 mm,3 m 或相当者;b)流动相流速:0.5 m L/m i n;c)柱温:4 0;d)进样量:2 0 L;e)梯度洗脱,流动相A
12、为甲醇,流动相B为0.1%(v/v)甲酸-5 mm o l/L 醋酸铵溶液,参考洗脱程序见表1。表1 高效液相色谱参考梯度洗脱程序时间/m i n流速/(m L/m i n)流动相A/%流动相B/%00.51 09 030.51 09 04.50.59 01 01 00.59 01 01 10.51 09 01 30.51 09 08.2.1.2 质谱参考条件质谱参考条件如下:a)电离方式:电喷雾(E S I+);b)扫描方式:正离子扫描;c)检测模式:多反应监测(MRM);d)雾化气、气帘气、辅助气、碰撞气均为高纯氮气;使用前应调节各参数使质谱灵敏度达到检测要求,参考条件及监测离子对(m/z
13、)参见表A.1。8.2.2 液相色谱-串联质谱测定8.2.2.1 定性测定按照液相色谱-串联质谱条件测定试样和基质混合标准工作液,试样中目标化合物的保留时间与基质混合标准工作液中对应化合物的保留时间偏差在2.5%之内;定性离子对的相对丰度与浓度相当的基质混合标准工作液的相对丰度一致,相对丰度偏差不超过表2的规定,且每个离子的信噪比均3,则3S N/T5 4 5 02 0 2 2以正式出版文本为准可判断试样中存在相应的被测物。表2 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度/%5 02 05 01 02 01 0允许的相对偏差/%2 02 53 05 08.2.2.2 定量测定本文件双稠吡
14、咯啶类生物碱采用外标法定量测定,根据样液中被测物的含量情况,选定浓度相近的标准工作溶液。标准溶液和样液中双稠吡咯啶类生物碱的响应值均应在仪器检测线性范围内。对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定。在上述仪器条件下,双稠吡咯啶类生物碱的参考保留时间见附录B。8.3 空白试验 除不称取试样外,均按上述测定条件和步骤进行。9 结果计算与表述用L C-M S/M S数据处理系统或按式(1)计算试样中双稠吡咯啶类生物碱的残留量:Xi=Ci-C0mV1 0 0 01 0 0 0(1)式中:Xi 试样中双稠吡咯啶类生物碱的残留量,单位为微克每千克(g/k g);Ci 标准工作溶液中生物碱的浓度,单位为纳克每
15、毫升(n g/m L);C0 由标准曲线而得到的空白试验样液中生物碱的含量,单位为纳克每毫升(n g/m L)V 样品定容体积,单位为毫升(m L);m 最终样液所代表的试样质量,单位为克(g)。注:计算结果需将空白值扣除结果,结果保留2位有效数字。1 0 定量限与回收率1 0.1 检出限和定量限野百合碱、克氏千里光宁、倒千里光碱、千里光菲灵碱、千里光宁、天芥菜碱、立可沙明碱、毛果天芥菜碱和蓝蓟定检出限均为3 g/k g,定量限均为1 0 g/k g。1 0.2 回收率样品的添加浓度及回收率数据见表C.1。4S N/T5 4 5 02 0 2 2以正式出版文本为准附 录 A(资料性)参考质谱条
16、件 质谱参考条件如下:a)电喷雾模式:E S I+;b)喷雾电压:5 5 0 0 V;c)去簇电压:8 0 V;d)帘气:3 7 9 k P a(5 5 p s i);e)碰撞气:3 4.5 k P a;f)离子源温度:5 5 0;g)雾化气:3 7 9 k P a(5 5 p s i);h)辅助气:2 4 1 k P a(3 5 p s i)。表A.1 定量离子对、监测离子对、去簇电压、碰撞气能量序号化合物定量离子对/(m/z)监测离子对/(m/z)去簇电压(D P)/V碰撞气能量(C E)/e V1倒千里光碱3 5 2.3/1 2 0.2 3 5 2.3/1 2 0.2 7 0.43 9.23 5 2.3/1 3 8.37 2.53 8.72野百合碱3 2 6.6/1 2 1.43 2 6.6/1 2 1.49 7.44 2.13 2 6.6/2 3 7.21 0 0.63 1.43千里光菲灵碱3 3 4.4/3 0 7.43 3 4.4/3 0 7.41 1 4.33 6.83 3 4.4/1 2 0.51 1 8.94 0.24千里光宁3 3 6.3/1 2 0.23 3 6.
