1、I C S0 7.1 0 0.3 0C C SX0 4中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T5 3 6 7.12 0 2 2 商品化试剂盒检测方法单核细胞增生李斯特氏菌 方法一C o mm e r c i a l k i t m e t h o d-L i s t e r i a m o n o c y t o g e n e s-T e s t m e t h o d 2 0 2 2-0 3-1 4发布2 0 2 2-1 0-0 1实施中华人民共和国海关总署发 布以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行 业 标 准商品化试剂盒检测方法单核细胞增生李斯特氏菌 方法一S N/T
2、5 3 6 7.12 0 2 2*中国海关出版社有限公司出版发行北京市朝阳区东四环南路甲1号(1 0 0 0 2 3)编辑部:(0 1 0)6 5 1 9 4 2 4 2-7 5 3 0网址 w ww.c u s t o m s k b.c o m/b o o k中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本8 8 01 2 3 0 1/1 6 印张0.7 5 字数2 2千字2 0 2 2年 月第一版 2 0 2 2年 月第一次印刷印数 1 *书号:1 5 5 1 7 57 0 3 定价1 2.0 0元以正式出版文本为准前 言 本文件按照G B/T 1.12 0 2 0 标准化工作导则 第1部分:标准化
3、文件的结构和起草规则 的规定起草。本文件是S N/T 5 3 6 7 商 品 化 试 剂 盒 检 测 方 法 单 核 细 胞 增 生 李 斯 特 氏 菌 的 第1部 分。S N/T 5 3 6 7已经发布了以下部分:第1部分:商品化试剂盒检测方法 单核细胞增生李斯特氏菌 方法一。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中国海关科学技术研究中心、中华人民共和国福州海关。本文件主要起草人:曾静、赵晓娟、刘莉、王紫薇、付溥博、徐蕾蕊、马丹、郑晶。S N/T5 3 6 7.12 0 2 2以正式出版文本为准以正
4、式出版文本为准商品化试剂盒检测方法单核细胞增生李斯特氏菌 方法一1 范围 本文件规定了食品中单核细胞增生李斯特氏菌的环介导恒温核酸扩增(l o o p-m e d i a t e d i s o t h e r m a l a m p l i f i c a t i o n,L AMP)检测(3 M MD S 单增李斯特氏菌分子检测试剂盒)方法。本文件适用于乳制品、肉制品、鱼类和海产品中单核细胞增生李斯特氏菌的筛选检测。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括
5、所有的修改单)适用于本文件。G B 4 7 8 9.3 0 食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验 G B/T 6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法 G B 1 9 4 8 9 实验室 生物安全通用要求 G B/T 2 7 4 0 3 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 S N/T 2 7 7 5 商品化食品检测试剂盒评价方法 S N/T 3 2 6 6 食品微生物检验方法确认技术规范3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 生物安全措施 为了保护实验室人员的安全和防止污染,应由具备资格的工作人员检测单核细胞增生李斯特氏菌。所有培养物、D NA提取
6、物和废弃物应按照G B 1 9 4 8 9和G B/T 2 7 4 0 3中的有关规定执行。5 技术概要 应用环介导恒温核酸扩增(L AMP)技术进行单核细胞增生李斯特氏菌的筛选检测。根据单核细胞增生李斯特氏菌属特有靶序列上的6个独立区域,采用6条特异引物通过稳定的B s t D NA聚合酶来驱动扩增反应,在6 0 左右完成恒温扩增。在环介导恒温核酸扩增反应中,焦磷酸盐(P P i)通过AT P-硫酸化酶被转化成三磷酸腺苷(AT P)。荧光素酶利用AT P发光,实现实时检测。6 试剂与材料 除有特殊说明外,所有实验室用试剂均为分析纯,实验用水符合G B/T 6 6 8 2中一级水的规定。1S
7、N/T5 3 6 7.12 0 2 2以正式出版文本为准6.1 3 M MD S 单核细胞增生李斯特氏菌分子检测试剂盒:本试剂盒参考S N/T 2 7 7 5和S N/T 3 2 6 6由国家认证认可监督管理委员会商品化食品检测试剂盒评价专家委员会组织评价。具体评价结果参见附录A。试剂盒避光储存于2 8,组成如下:a)裂解溶液(透明管中的粉红溶液 L S管);b)扩增试剂管(含有冻干试剂小球,黄色试管);c)阳性对照(R C);d)盖子(黄色盖)。注:如商品化试剂盒关键技术指标发生变动时,以试剂盒说明书操作为准。6.2 单核细胞增生李斯特氏菌质控菌株(AT C C 1 3 9 3 2)。6.3
8、 D e m i-F r a s e r培养基(含柠檬酸铁铵):见B.1。6.4 F r a s e r培养基(含柠檬酸铁铵):见B.2。6.5 3%8 4消毒液。7 仪器和设备除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:a)3 M分子检测仪器;b)移液器:量程1 0 L1 0 0 L;c)水浴锅或加热模块:1 0 0 1;d)均质器;e)计时器;f)恒温培养箱:3 6 1;g)电子天平:感量 0.1 g。8 检测程序 食品中单核细胞增生李斯特氏菌L AMP检测程序见图1。2S N/T5 3 6 7.12 0 2 2以正式出版文本为准图1 食品中单核细胞增生李斯特氏菌L AMP检测
9、程序9 操作步骤9.1 样品制备、增菌培养9.1.1 将D e m i-F r a s e r肉汤培养基温度平衡到室温。9.1.2 以无菌操作取样品2 5 g(m L)加入含有2 2 5 m L D e m i-F r a s e r肉汤增菌液的均质袋中,在拍击式均质器上连续均质2 m i n,于3 6 1 培养2 8 h3 0 h;奶酪和鱼类样品需进行二次增菌,于3 6 1 培养2 0 h2 4 h,移取0.1 m L D e m i-F r a s e r肉汤增菌液转种于1 0 m L F r a s e r肉汤增菌液内,于3 6 1 培养2 0 h2 4 h。9.2 细菌模板D N A的
10、制备(裂解)从9.1获得的D e m i-F r a s e r肉汤增菌液或F r a s e r肉汤增菌液,采用如下方法制备模板D NA。a)将裂解溶液(L S)管的温度平衡到室温。b)用移液器吸取2 0 L 9.1.2中增菌液转移到L S管内。c)当加热模块的温度达到1 0 0 1 时,将无盖L S管放在加热模块中加热1 5 m i n 1 m i n,随着温度的变化L S管中溶液的颜色会从粉红变为黄色。d)从加热模块中取出L S管,将其放在冷却架冷却5 m i n1 0 m i n直至其颜色恢复为粉红色,即为模板D NA。3S N/T5 3 6 7.12 0 2 2以正式出版文本为准9.
11、3 环介导恒温核酸扩增(L AMP)反应9.3.1 阴性对照、阳性对照设置 每次反应必须设置阴性对照和阳性对照。阴性对照以无菌增菌培养基(如D e m i-F r a s e r肉汤)替代D NA模板,请勿将水用做阴性对照。阳性对照为试剂盒提供的R C。每个样品设置两个平行反应。9.3.2 扩增过程9.3.2.1 吸取L S管中D NA模板2 0 L至扩增试剂管(含有冻干试剂小球),成一定角度缓慢加入,以避免搅动小球,轻轻上下吹吸5次,使小球溶解并充分混匀,加盖黄色盖子并确保盖子盖紧。9.3.2.2 D NA模板添加顺序应为:待测样品、阴性对照和阳性对照,以避免交叉污染。9.3.2.3 将反应
12、管装进3 M分子检测快速转移托盘,关闭并锁定托盘盖。9.3.2.4 在3 M分子检测软件中查看和确认配置的检测,在软件中单击启动按钮,仪器盖自动打开。9.3.2.5 将3 M分子检测快速转移托盘放入3 M分子检测仪器并关闭盖,启动分析。9.3.2.6 为了避免因为交叉污染而导致的假阳性结果,在分析完成后,将快速转移托盘浸入3%8 4消毒液1 h,且始终远离分析准备区。9.4 结果观察 7 5 m i n完成扩增,仪器实时自动报告检测结果,具体结果见附录C。1 0 结果报告 在阴性对照和阳性对照结果均有效的情况下:a)阳性结果,对样品增菌液进一步按照G B 4 7 8 9.3 0中操作步骤进行确
13、认后报告检出单核细胞增生李斯特氏菌;b)阴性结果,报告未检出单核细胞增生李斯特氏菌;c)若与上述条件均不符,则本次结果无效,应更换试剂按本方法重新检测。4S N/T5 3 6 7.12 0 2 2以正式出版文本为准附 录 A(资料性)单核细胞增生李斯特氏菌L AMP检测试剂盒评价结果1)1)本评价结果仅适用于3 M MD S 单增李斯特氏菌分子检测试剂盒。A.1 包容性和排他性 选择5 5株经确认的单核细胞增生李斯特氏菌标准菌株和分离菌株,用L AMP试剂盒方法进行测试,结果全部为阳性。选择3 0株经确认的非单核细胞增生李斯特氏菌的标准菌株,用试剂盒方法进行测试,结果全部为阴性。A.2 灵敏度
14、、特异性、准确度及检出限 选择5个食品种类,1 5个食品类型的样品,采用人工污染的方式分别制备未接种(L 0)、低(L 1)、高(L 2)三个污染水平的试验样品,分别用L AMP方法和G B 4 7 8 9.3 0方法进行测试,相对灵敏度、特异性、准确度及检出限结果见表A.1。表A.1 灵敏度、特异性、准确度及检出限序号食品基质相对灵敏度S E相对特异性S P相对准确度A C检出限(C F U/g)1乳粉1 0 0%1 0 0%1 0 0%0.1 9 2奶酪1 0 0%1 0 0%1 0 0%0.1 9 3肉制品1 0 0%1 0 0%1 0 0%0.1 9 4灭菌乳1 0 0%1 0 0%1
15、 0 0%0.1 9 5鱼类和海产品1 0 0%1 0 0%1 0 0%0.1 9 A.3 耐变性 分别对裂解时间(正常设置为1 5 m i n)、裂解体积(正常设置为2 0 L)和反应体积(正常设置为2 0 L)三个变量进行耐变性实验,检测结果表明,在裂解时间变化2 m i n、裂解体积变化2 L和反应体积变化2 L的情况下,对单增李斯特氏菌分子检测试剂盒方法的检出率没有影响。A.4 批间变异 取3个不同批号试剂盒分别对含目标菌和非目标菌样品进行批间差异实验,检测结果表明,该试剂盒无显著性批间差异。A.5 评价结论 试剂盒方法检测结果与参考标准方法检测结果无显著差异,能满足食品样品的检测要求
16、。5S N/T5 3 6 7.12 0 2 2以正式出版文本为准附 录 B(规范性)培养基和试剂B.1 D e m i-F r a s e r 培养液(含柠檬酸铁铵)配方B.1.1 成分 氯化钠2 0 g 磷酸氢钠9.6 g 浓缩牛肉汁5.0 g 酪蛋白胰酶消化物5.0 g 动物组织胃蛋白酶消化物5.0 g 酵母抽提物5.0 g 氯化锂3.0 g 磷酸二氢钾1.3 5 g 马栗树糖1.0 g 盐酸吖啶黄0.0 1 2 5 g 那利敌新锭0.0 1 g 柠檬酸铁铵(0.5 g/1 0 m L)1 0 m L 蒸馏水1 0 0 0 m LB.1.2 制法 将除柠檬酸铁铵以外的各成分加入蒸馏水中,搅混均匀,静置约1 0 m i n,煮沸溶解,调节p H至7.20.2,高压灭菌1 2 1 1 5 m i n。待培养基温度冷至5 0 以下时,按1 0 0 0 m L培养基内加1 0 m L柠檬酸铁铵。B.2 F r a s e r 培养液(含柠檬酸铁铵)配方B.2.1 成分 氯化钠2 0 g 磷酸氢钠9.6 g 浓缩牛肉汁5.0 g 酪蛋白胰酶消化物5.0 g 动物组织胃蛋白酶消化物5.0 g
