1、广西医科大学学报JOURNAL OF GUANGXI MEDICAL UNIVERSITY2023 Jan；40（1）基于CRISPR/Cas9技术构建GP73基因敲除小鼠模型及表型验证*徐艺心1，甄兰1，黄庆1，莫运海1，吴飞翔1,2,3（1.广西医科大学附属肿瘤医院肝胆外科，南宁530021；2.广西肝癌诊疗工程技术研究中心，南宁530021；3.区域性高发肿瘤早期防治研究教育部重点实验室，南宁530021）摘要目的：基于CRISPR/Cas9技术构建高尔基体73（GP73）基因敲除小鼠模型并对其表型进行初步验证。方法：利用非同源末端连接（NHEJ）修复引入突变的方式，造成GP73基因蛋白
2、读码框移码，使其功能缺失，针对GP73基因外显子4设计sgRNA靶位点，体外转录获得sgRNA，与编码Cas9的mRNA混合后通过受精卵显微注射方法获得F0代阳性敲除小鼠，通过繁育及基因型鉴定获得GP73基因敲除纯合子小鼠（GP73-/-小鼠）。采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测肝、肾、皮下脂肪、棕色脂肪组织中GP73mRNA表达，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测血清GP73蛋白水平。结果：与野生型（WT）小鼠相比，GP73-/-小鼠肝、肾、皮下脂肪、棕色脂肪组织GP73 mRNA及蛋白表达水平降低，血清GP73蛋白水平降低（均P0.05）。结论：基于CRISPR/Cas9
3、技术成功构建了GP73基因敲除小鼠。关键词CRISPR/Cas9；GP73；基因敲除；基因型鉴定中图分类号：R392文献标志码：A文章编号：1005-930X（2023）01-0107-05DOI：10.16190/ki.45-1211/r.2023.01.017Construction of GP73 knockout mouse model based on CRISPR/Cas9 technology and phenotype validationXu Yixin1,Zhen Lan1,Huang Qing1,Mo Yunhai1,Wu Feixiang1,2,3.(1.Departm
4、ent of Hepatobiliary Surgery,Affili-ated Tumor Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021,China;2.Guangxi Liver Cancer Diagno-sis and Treatment Engineering and Technology Research Center,Nanning 530021,China;3.Key Laboratory ofEarly Prevention and Treatment for Regional High Frequency Tum
5、or,Ministry of Education,Nanning 530021,China)AbstractObjective：AGolgi 73(GP73)knockout mouse model was constructed and its phenotype was initial-ly validated based on CRISPR/Cas9 technology.Methods:Non-homologous endjoining(NHEJ)was used to re-pair and introduce a mutation that caused a read frame
6、shift in theGP73gene,resulting in a loss of function.ThesgRNA target sites were designed for exon 4 of theGP73gene,and sgRNA was obtained byin vitrotranscrip-tion.After mixing with mRNA encoding Cas9,F0 generation positive knockout mice were obtained by microin-jection of fertilized eggs,andGP73knoc
7、kout homozygous mice(GP73-/-mice)were obtained by breeding andgenotype identification;real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction(RT-qPCR)was used to de-tectGP73mRNA expression in liver,kidney,subcutaneous adipose tissue and brown adipose tissue,and serumGP73 protein level was dete
8、cted by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).Results:Compared with wild-type(WT)mice,GP73 mRNA and protein expressions in liver,kidney,subcutaneous adipose tissue as well asbrown adipose tissue and serum GP73 protein levels of GP73-/-mice decreased(allP0.05).Conclusion:GP73knockout mouse models
9、are successfully constructed based on CRISPR/Cas9 technology.KeywordsCRISPR/Cas9；Golgi 73；gene knock-out；genotype identification*基金项目：区域性高发肿瘤早期防治研究教育部重点实验室子课题（No.GKE2019-06；No.GEK-ZZ202004）通信作者，E-mail：收稿日期：2022-10-14 107广西医科大学学报2023 Jan；40（1）高尔基体蛋白73（GP73）最早是2000年由美国学者通过对患有成人巨细胞肝炎的患者肝脏进行cDNA文库差异筛选时发
10、现的，是肝脏胆管上皮细胞表达的特异性膜蛋白1。研究表明，GP73在病毒性肝炎（乙肝、丙肝）和非病毒性原因（自身免疫性、酒精性、非酒精性）所引起的肝病中的表达升高2。肝细胞癌（HCC）患者血清GP73水平显著升高，且GP73诊断HCC的灵敏度和特异度高于甲胎蛋白（AFP）3。近年来，随着GP73分子机制研究的逐步深入，GP73在代谢功能中的重要性也逐渐体现出来。研究发现，血中GP73受机体营养状态的调控，在饥饿时通过调节cAMP-PKA-CREB通路上调糖异生关键酶的表达，靶向肝细胞促进肝脏产糖4。另有研究表明，GP73参与内质网应激下的SCAP/SREBPs脂质代谢通路，上调脂质合成相关基因的
11、表达，促进脂质堆积，引起脂代谢紊乱5。此外，GP73还是一种GAP酶，GP73通过其GAP活性抑制极低密度脂蛋白（VLDL）从肝内向肝外输出，使肝脏中的脂类排出受阻，造成非肥胖型非酒精性脂肪肝（NAFLD）6。以上研究结果均体现GP73在糖脂代谢中的重要地位，为了进一步阐明GP73在机体代谢中的作用，本研究通过CRISPR/Cas9技术构建GP73基因敲除小鼠模型，并对其表型进行初步验证。1材料与方法1.1实验动物8周龄SPF级雄性C57BL/6小鼠，体重2025 g，购自北京斯贝福公司，动物生产许可证号为：SCXK（京）2019-0010。本研究通过广西医科大学动物伦理委员会审批。1.2主要
12、试剂PCR试剂盒购自Bimake公司；RNA分离试剂购自德国MACHEREY-NAGEL公司；BCA试剂盒购自赛默飞公司；RIPA裂解液购自碧云天公司；小鼠GP73抗体购自博士德公司；内参-Tubulin抗体购自Abcam公司；HRP标记的山羊抗小鼠以及山羊抗兔抗体IgG均购自于中杉金桥；GP73蛋白检测试剂盒购自武汉云克隆公司。1.3实验方法1.3.1sgRNA设计在NCBI网站查到小鼠GP73基因定位（gene ID：105348）于13号染色体上（Chro-mosome13：NC_000079.7），含有11个外显子，4个转录本。根据小鼠GP73基因的结构，通过在线sgRNA设计网站（h
13、ttp:/ Ensembl 号：Golm1-201（ENSMUST00000022039.6），选择敲除区域为外显子 4（exon 4）区，在 exon 4 区上、下游序列中选择sgRNA 靶位点，sgRNA 靶序列信息如下：sgRNA 1：5-CTGGACAAGCCTTCATCCCTTGG-3，sgRNA2：5-TGCCTTCTGACCTTGGCCTGAGG-3。1.3.2 阳性基因敲除品系获得及鉴定在高倍显微镜下，用显微操作器控制显微注射针向 C57BL/6野生型（WT）小鼠的受精卵中注射Cas9mRNA 和sgRNA，并将注射后的受精卵移植到假孕母鼠中，新出生的小鼠为F0代小鼠。由于受精
14、卵早期卵裂速度很快，因此得到的F0代小鼠为嵌合体，不一定具备稳定遗传的能力，因此需要传代才可获得具有稳定遗传能力的F1代小鼠。通过PCR扩增及测序方法鉴别出阳性F0代小鼠，鉴定的上、下游引物序列如下：P1：5-GTCACAACGAAGCCGACTGAC-CTACAT-3，P2：5-GCGAGTTTCAGGACAGTT-AAGGCTGC-3。挑选出阳性F0代小鼠与WT小鼠交配，获得GP73敲除F1代杂合子（GP73-/+）小鼠，鉴定方法同 F0 代阳性小鼠。PCR 反应程序为：94 预变性3 min；98 变性15 s，60 退火15 s，68 延伸 1 min，共 35 个循环；最后 68 延
15、伸 5min。将获得的GP73-/+小鼠通过自交得到F2代基因敲除纯合子（GP73-/-）小鼠，并进行敲除验证和表型分析。1.3.3基因敲除小鼠基因型鉴定随机选取13只F2代雄鼠，剪尾，行基因型鉴定，将剪取的鼠尾置于1.5 mL EP管中，每管加入新鲜配置的100 L鼠尾裂解液，55 金属浴消化 1 h，95 水浴 5 min，12 000 r/min离心5 min，取上清，作为PCR模板进行PCR琼脂糖凝胶电泳。腹腔注射戊巴比妥钠麻醉小鼠，取肝、肾、皮下脂肪、棕色脂肪，提取组织总RNA，反转录为cDNA后进行PCR扩增。以GAP-DH为内参，采用2-CT法计算GP73mRNA相对表达量。PC
16、R引物序列见表3。1.3.4Western blotting法检测组织GP73蛋白表达腹腔注射戊巴比妥钠麻醉小鼠，取小鼠肝、肾、皮下脂肪、棕色脂肪，加入RIPA裂解液提取组织总蛋白，BCA法进行蛋白定量；SDS-PAGE电泳分离蛋白，将蛋白转移至PVDF膜，10%脱脂奶粉封闭1 h；加入一抗GP73（1 1 000）、GAPDH（1 10 000）108稀释液4 孵育过夜，洗膜3次，每次5 min；加入HRP标记的二抗（1 10 000）室温孵育1 h，洗膜3次，每次5 min，ECL显色，暗室曝光显影。用Image J软件分析蛋白条带灰度值，以GP73蛋白条带灰度值与内参GAPDH条带灰度值的比值为GP73蛋白相对表达量。表3PCR引物序列引物GP73-KOGP73GAPDH上游下游上游下游上游下游序列（5 3）TTGCTTGTAGTAGGCCTCTTTGTCATCTCAGGTCACCGGGTTTAGCAGAGGTCGGTGTGAACGGATTTGTGTAGACCATGTAGTTGAGGTCAAGGTCGGTGTGAACGGATTTGTGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA1.
