1、306 2023,Vol.44,No.04 食品科学 安全检测基于Cu,Fe-N-C氧化酶活性构建邻苯二甲酸酯荧光检测探针李 宏1,2，史 巧1，陈骏飞1，王馨蕊1，汤回花1，李秋兰2，杨德志2，杨亚玲2,*（1.云南省农业科学院农产品加工研究所，云南 昆明 650221；2.昆明理工大学生命科学与技术学院，云南 昆明 650500）摘 要：基于邻苯二甲酸酯（phthalic acid ester，PAEs）对双金属原子Cu,Fe-N-C纳米酶模拟氧化酶活性的调节，建立简单、灵敏测定发酵食品中PAEs的荧光探针方法。PAEs吸附于Cu,Fe-N-C表面后，会加速Cu,Fe-N-C催化氧化底物邻
2、苯二胺，使生成的2,3-二氨基吩嗪产物荧光强度增加，PAEs在1.2550 g/L范围内呈良好的线性关系。将该研究方法用于PAEs含量的测定，其检出限可达到0.76 g/L，实际样品的加标回收率在88.0%104.6%范围内，满足GB 5009.2712016中的检测要求。该方法具有简便、稳定、快速等特点，其检出限也低于国家规定的食品中PAEs含量的限值。关键词：邻苯二甲酸酯；纳米酶；氧化酶活性；荧光探针A Fluorescent Probe Based on Cu,Fe-N-C Nanozyme with Oxidase-like Activity for Detection of Phth
3、alate EstersLI Hong1,2,SHI Qiao1,CHEN Junfei1,WANG Xinrui1,TANG Huihua1,LI Qiulan2,YANG Dezhi2,YANG Yaling2,*(1.Institute of Agro-products Processing,Yunnan Academy of Agricultural Sciences,Kunming 650221,China;2.Faculty of Life Science and Technology,Kunming University of Technology,Kunming 650500,
4、China)Abstract:A simple and sensitive fluorescent probe for the determination of phalic acid ester(PAEs)in fermented foods was developed based on the fact that the oxidase-like activity of Cu,Fe-N-C nanozyme can be regulated by PAEs.After PAEs were adsorbed on the surface of Cu,Fe-N-C,the catalytic
5、oxidation of the substrate o-phenylenediamine(OPD)was accelerated,thus increasing the fluorescence intensity of the generated 2,3-diaminophenazine(DAP).The calibration curve for PAEs showed a good linear relationship in the concentration range of 1.2550 g/L.The detection limit of the proposed method
6、 was 0.76 g/L.The recoveries of spiked samples ranged from 88.0%to 104.6%,which meet the detection requirements of the national standard GB 5009.271-2016.This method is simple,stable and rapid,and its detection limit is lower than the national limit for PAEs content in foods.Keywords:phthalic acid e
7、sters;nanozyme;oxidase-like activity;fluorescent probeDOI:10.7506/spkx1002-6630-20211213-143中图分类号：TS255.7 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2023）04-0306-07引文格式：李宏,史巧,陈骏飞,等.基于Cu,Fe-N-C氧化酶活性构建邻苯二甲酸酯荧光检测探针J.食品科学,2023,44(4):306-312.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20211213-143.http:/ LI Hong,SHI Qiao,CHEN Junfei,et al.A
8、fluorescent probe based on Cu,Fe-N-C nanozyme with oxidase-like activity for detection of phthalate estersJ.Food Science,2023,44(4):306-312.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-20211213-143.http:/收稿日期：2021-12-13基金项目：云南省重大科技专项（202002AE320006）第一作者简介：李宏（1974）（ORCID:0000-0002-0877
9、-8867），男，研究员，硕士，研究方向为农产品加工。E-mail:*通信作者简介：杨亚玲（1964）（ORCID:0000-0003-0115-7563），女，教授，博士，研究方向为分析化学。E-mail:邻苯二甲酸酯（phthalic acid esters，PAEs）是一个化合物系列，主要用于生产柔性聚氯乙烯或乙烯基产品，是最常用的塑化剂之一。PAEs与塑料主体以分子间相互作用力的形式结合，较易转移到各种环境中，对空安全检测 食品科学 2023,Vol.44,No.04 307气、土壤、水源甚至食品造成污染1-3。PAEs是一种环境激素类物质，可在生物体内富集而产生毒性作用，引起肝脏、免
10、疫、生殖内分泌和胚胎发育毒性等，严重威胁人们的身体健康4-6。我国在2016年发布了关于PAEs的食品国家标准，对食品中PAEs含量限制范围作出明确规定7-8。目前，PAEs检测主要有气相色谱法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用技术、高效液相色谱-质谱联用技术、近红外光谱分析技术、荧光光谱法以及实时荧光定量聚合酶链式反应技术等9-15。荧光光谱法具有检测便捷、灵敏度高、重现性好、强选择性等优势16，但由于PAEs分子本身不能发出荧光17-18，各种PAEs的荧光检测主要集中在对PAEs进行衍生，通过间接荧光 法检测PAEs19-20。自2007年我国科学家阎锡蕴发现四氧化三铁磁性纳米颗粒本身
11、具有类过氧化物酶的催化活性以来21，纳米酶的研究得到快速发展，由于其稳定性高、易于生产及成本低，可作为天然酶的替代品等优势，成为研究 热点22-23。其中单原子纳米酶由于与天然金属酶的M-Nx位点相似，表现出优异的催化活性及选择性，受到广泛关注24，在单原子纳米酶中引入第2个过渡金属原子，可以改善酶活性，提高对底催化的选择性25-27。本研究利用热解法合成了铜、铁双原子纳米酶（Cu,Fe-N-C），基于PAEs调节Cu,Fe-N-C氧化物模拟酶活性，建立荧光检测新方法。如图1所示，Cu,Fe-N-C能催化邻苯二胺（o-phenylenediamine，OPD）生成黄色荧光产物2,3-二氨基吩嗪
12、（2,3-diaminophenazine，DAP）。而PAEs的加入会增强催化体系的荧光强度，由此建立痕量PAEs的荧光探针检测方法。邻苯二甲酸二甲酯（dimethyl phthalate，DMP）、邻苯二甲酸二乙酯（diethyl phthalate，DEP）、邻苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate，DBP）、邻苯二甲酸二辛酯（dioctyl phthalate，DOP）、邻苯二甲酸二壬酯（dinonyl phthalate，DINP）5 种PAEs类物质有此现象，该方法检测这5 种PAEs的总量。OPDOPD:DAP:PAEs:NH2NH2OOORORNH2NNNH2DAP
13、PAEsCu,Fe-N-C图 1 PAEs检测示意图Fig.1 Schematic diagram of PAE detection1 材料与方法1.1 材料与试剂酱腌菜样品，购自云南昆明市呈贡区超市。DMP、DEP、DBP、DOP、DINP、（分析纯，纯度99%）中国医药集团上海化学试剂公司；氯化铜（CuCl2）、氯化铁（FeCl3）、中-四(4-羧基苯基)卟吩、甲醇、3,3,5,5-四甲基联苯胺（3,3,5,5-tetramethylbenzidine，TMB）、OPD、2,2-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline
14、-6-sulfonic acid)，ABTS）上海阿拉丁生化科技股份有限公司。1.2 仪器与设备GS800A分子荧光光谱仪 安捷伦科技（中国）有限公司；UV-2600紫外-可见分光光度计 岛津（上海）实验器材有限公司；Tecnai G2 TF30场发射透射电子显微镜 荷兰FEI公司；X射线衍射仪、TENsoR27型傅里叶红外光谱分析仪 德国Bruker公司；XW-800快速混匀器 上海汗诺仪器有限公司；HC-3018R型高速离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；高温管式炉 上海贝克有限公司；电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；pHS-3B精密酸度计 赛多利斯（上海）贸易有限公司；78
15、-1型磁力加热搅拌器 上海南汇电讯器材厂；AB204-S电子分析 天平 梅特勒-托利多科技（中国）有限公司。1.3 方法1.3.1 Cu,Fe-N-C材料的制备参照Lin Zhen28和Huang Xuemin29等的研究进行改进。对配体分子的筛选，材料制备方法如下：10 mL甲醇中含有2.636 g CuCl2作为溶液A，20 mL甲醇中含有5 g中-四(4-羧基苯基)卟吩和2.376 g FeCl3（按Cu、Fe物质的量比1 1计算得到）作为溶液B，将A和B两种溶液均匀混合并80 烘箱干燥老化2 h。得到的墨绿色干燥粉末称取5 g于石英舟中，管式炉750 在N2保护下煅烧2 h得到黑色粉末
16、。粉末于硫酸溶液（H2SO4 H2O=1 9，V/V）中12 h浸泡后用水反复冲洗。干燥后，后续用实验用水配制成质量浓度为0.5 mg/mL的悬浮液使用。1.3.2 PAEs的检测以DMP为PAEs的模式物，在EP管中依次加入100 L Cu,Fe-N-C和50 L 100 mmol/L OPD，一定质量浓度的DMP标准溶液，2 mL pH 8.0磷酸盐缓冲溶液，充分混匀，室温孵育10 min后，于8 000 r/min离心3 min，取上层清液在421 nm激发波长下，564 nm发射波长处测定荧光强度。设定I=II0，I表示加入DMP后溶液的荧光强度；I0表示未加入DMP作空白时溶液的荧光强度。308 2023,Vol.44,No.04 食品科学 安全检测1.3.3 Cu,Fe-N-C材料酶活性的测定采用TMB及ABTS显色反应测定Cu,Fe-N-C纳米酶的活性。首先，将100 L Cu,Fe-N-C、100 mmol/L的TMB及ABTS各50 L，加入到2 mL pH 4.0醋酸-醋酸钠缓冲溶液，充分混匀，室温孵育10 min后，于8 000 r/min离心3 min，取上层清
