1、课题课题2 2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 专题专题2 2 微生物的培养与应用微生物的培养与应用 一、课题背景一、课题背景 1 1、尿素的利用尿素的利用 尿素尿素是一种重要的是一种重要的农业氮肥农业氮肥。尿素。尿素不能直接不能直接被被农作物农作物吸收吸收。土壤中的细菌将尿素。土壤中的细菌将尿素分解成氨分解成氨之后之后才能被植物利用。才能被植物利用。2 2、细菌利用尿素的原因、细菌利用尿素的原因 土壤中的细菌分解尿素是因为它们土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶能合成脲酶 CO(NHCO(NH2 2)2 2 脲酶脲酶 +H+H2 2O O +CO+CO2
2、 2 2NH2NH3 3 3 3、常见的分解尿素的微生物、常见的分解尿素的微生物(异养需氧型异养需氧型)芽孢杆菌芽孢杆菌、小、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌。某些真菌和放线菌。硝化细菌、固氮菌、根瘤菌：硝化细菌、固氮菌、根瘤菌：硝化细菌硝化细菌 固氮菌固氮菌 根瘤菌根瘤菌 代谢方式代谢方式 自养需氧型自养需氧型 异养需氧型异养需氧型 异养需氧型异养需氧型 能量来源能量来源 NH3 有机物有机物 豆科植物的有机物豆科植物的有机物 转换过程转换过程 将将NH3转变成转变成NO2-、NO3-固氮酶催化机理总反
3、应式固氮酶催化机理总反应式为：为：N2+8 e-+8 H+16 Mg ATP+16 H2O2 NH3+H2+16Mg ADP+16 Pi 在固氮酶的作用下，在固氮酶的作用下，根瘤中的菌体将分根瘤中的菌体将分子态氮转化为氨态子态氮转化为氨态氮（同左）氮（同左）4 4、课题目的、课题目的 从土壤中分离出能够分解尿素的细菌从土壤中分离出能够分解尿素的细菌 统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌 一一.研究思路研究思路.筛选菌株筛选菌株.统计菌落数目统计菌落数目.设置对照设置对照 1 1、实例：、实例：启示：启示：寻找寻找目的菌种目的菌种时要根据它对时要根据它
4、对生存环境生存环境的的 要求，到相应的环境中去寻找。要求，到相应的环境中去寻找。原因：原因：因为热泉温度因为热泉温度707080800 0C C，淘汰了绝大，淘汰了绝大多多 数微生物只有数微生物只有TaqTaq细菌被筛选出来。细菌被筛选出来。DNADNA多聚酶链式反应多聚酶链式反应是是一种在体外将一种在体外将少量少量DNADNA大量复制大量复制的技术，此项的技术，此项技术要求使用技术要求使用耐高温耐高温（93930 0C C）的）的DNADNA聚合酶聚合酶。2、实验室中微生物的筛选原理：、实验室中微生物的筛选原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度
5、、包括营养、温度、pH等等)，同时抑制，同时抑制或阻止其他微生物生长。或阻止其他微生物生长。15.0g15.0g 琼脂琼脂 1.0g1.0g 尿素尿素 10.0g10.0g 葡萄糖葡萄糖 0.2g0.2g MgSOMgSO447H7H2 2O O 2.1g2.1g NaHNaH2 2POPO4 4 1.4g1.4g KHKH2 2POPO4 4 3 3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：从物理性质看此培养基属于哪类？从功能上从物理性质看此培养基属于哪类？从功能上属属于哪类培养基？于哪类培养基？固体培养基固体培养基 在此培养基中哪些作为碳源、
6、氮源？在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：碳源：葡萄糖、尿素葡萄糖、尿素 氮源：氮源：尿素尿素 选择培养基选择培养基 唯一氮源唯一氮源 思考思考2该培养基对微生物该培养基对微生物 （具（具有，不具有）选择作用。如果具有，其有，不具有）选择作用。如果具有，其选择机制是选择机制是 。具有具有 只有能够以尿素作为氮源的微生只有能够以尿素作为氮源的微生物才能在该培养基上生长物才能在该培养基上生长 培养基的培养基的氮源为尿素氮源为尿素，只有能合成，只有能合成脲酶脲酶的微生物的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生
7、长繁生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长繁殖，而受到抑制，所以用此殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出培养基就能够选择出分解尿素的微生物分解尿素的微生物。4 4、培养基选择分解尿素的微生物的原理、培养基选择分解尿素的微生物的原理 选择培养基：选择培养基：在微生物学中，将允许在微生物学中，将允许特定特定种类的微生物生长种类的微生物生长，同时，同时抑制或阻止其他种类抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基微生物生长的培养基。几种几种常见常见选择培养基选择培养基 1、加入青霉素的培养基加入青霉素的培养基 分离酵母菌、霉菌等真菌分离酵母菌、霉菌等真菌 2、不加氮源的无氮培养基不加氮源的无氮培养基
8、 分离固氮菌分离固氮菌 3、不加含碳有机物的无碳培养基不加含碳有机物的无碳培养基 分离自养型微生物分离自养型微生物 4、加入加入高浓度食盐高浓度食盐的培养基的培养基 分离分离金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌 1.1.间接计数法（间接计数法（活菌计数法活菌计数法）（1 1）常用方法：）常用方法：每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数(C(CV)V)M M 其中，其中，C C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，落数，V V代表涂布平板时所用的稀释液的体积代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)(ml)，M M代表稀释倍数。代表稀释倍数。当样品的稀释度足够高时，培养基
9、表当样品的稀释度足够高时，培养基表 面生长的一个菌落，来源于样品稀释面生长的一个菌落，来源于样品稀释 液中的一个活菌，通过统计平板上的液中的一个活菌，通过统计平板上的 菌落数，就能推测出样品中大约含有菌落数，就能推测出样品中大约含有 多少活菌。多少活菌。（2）原理：）原理：稀释涂布平板法。稀释涂布平板法。.统计菌落数目：统计菌落数目：注意事项注意事项:为了保证结果准确，一般选择菌落数在为了保证结果准确，一般选择菌落数在3030300300的平板上进行计数。的平板上进行计数。为使结果接近真实值可将为使结果接近真实值可将同一稀释度涂布至同一稀释度涂布至少少3 3个平板个平板，经涂布，培养计算出菌落
10、平均数。，经涂布，培养计算出菌落平均数。统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。如何从平板上的菌落数推测出每克如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？样品中的菌落数？统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均个平板，计算出平板菌落数的平均值，然后按课本旁栏的公式进行计算值，然后按课本旁栏的公式进行计算 教材教材P22 2 2、显微镜直接计数：、显微镜直接计数：利用利用血球计数板血球计数板，在显微镜下计算一定容积里，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。样品中微生物的数量。.统计
11、菌落数目：统计菌落数目：不能区分死菌与活菌；不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；个体小的细菌在显微镜下难以观察；缺点缺点 实例分析实例分析P22 你认为哪个同学的结果更接近真实你认为哪个同学的结果更接近真实值？值？你认为这两位同学的实验需要改进你认为这两位同学的实验需要改进吗？如果需要，如何改进？吗？如果需要，如何改进？实例分析实例分析P22 第一同学只涂布了一个平板，第一同学只涂布了一个平板，没有设置没有设置重复组，因此结果不具有说服力。重复组，因此结果不具有说服力。第二位同学考虑到设
12、置重复组的问题，第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了三个平板，但是涂布了三个平板，但是其中其中1个平板的计个平板的计数结果与数结果与2个相差太远，说明在操作过程个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地中可能出现了错误，因此，不能简单地将将3个平板的计数值用来求平均值个平板的计数值用来求平均值。设置对照的主要目的是排除实验组设置对照的主要目的是排除实验组中非测试中非测试因素因素对实验结果的影响，提高实验结果的对实验结果的影响，提高实验结果的可信度可信度。（三）（三）.设置对照：设置对照：实例：教材实例：教材P23P23 原因：原因：土样不同土样不同 培养基污染或操作失误培
13、养基污染或操作失误(或者是混入了或者是混入了其他的含氮物质其他的含氮物质)小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，说服力，对照的设置是必不可少的对照的设置是必不可少的。方案一：由其他同学用与方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验同学相同土样进行实验 方案二：将方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。否受到污染。结果预测：如果结果与结果预测：如果结果与A同学一致，则证明同学一致，则证明A无误；无误；如果结果不同，则证
14、明如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养同学存在操作失误或培养基的配制有问题。基的配制有问题。菌落计数菌落计数 配制土壤配制土壤溶液溶液 系列稀释系列稀释 涂布平板涂布平板与培养与培养 根据图示根据图示27填写以下实验流程：填写以下实验流程：实验设计：实验设计：实验的具体操作实验的具体操作 .土壤取样（微生物的天然培养基）土壤取样（微生物的天然培养基）从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土土3cm3cm左右，再取样（左右，再取样（3 3-8cm8cm），将样品装入事），将样品装入事先准备好的信封中。先准备好的信封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使
15、取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。用前都要灭菌。.制备培养基：制备培养基：制备以制备以尿素为唯一氮源尿素为唯一氮源的选择培养基。的选择培养基。准备准备牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基和和选择培养基选择培养基将菌将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，因此，牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基可以作为可以作为对照对照，用来用来判断选择培养基是否起到了选择作用判断选择培养基是否起到了选择作用。由于初次。由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因
16、此选择了一实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为个较为宽泛的范围：稀释倍数为10103 310107 7。每个。每个稀释度下需要稀释度下需要3 3个个选择培养基，选择培养基，1 1个牛肉膏蛋白胨个牛肉膏蛋白胨培养基，因此共需要培养基，因此共需要1515个选择培养基，个选择培养基，5 5个牛肉个牛肉膏蛋白胨培养基。此外，还需要准备膏蛋白胨培养基。此外，还需要准备8 8个个灭菌的试灭菌的试管和管和1 1个个灭菌的移液管。灭菌的移液管。应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤10g10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行 分离不同的微生物采用不同的稀释度分离不同的微生物采用不同的稀释度 原因：原因：不同微生物在土壤中含量不同不同微生物在土壤中含量不同 目的：目的：保证获得菌落数在保证获得菌落数在3030300300之间、适于之间、适于计数的平板计数的平板 三三样品的稀释样品的稀释 为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解测定土
