1、DB45/T2026-20195.1样品准备每份样品至少采集两批，每批采集的样品均包括参照品种ROC22和桂糖11号：单次采集的样品独立进行实验，作为一次重复。5.2DNA提取取嫩叶组织约0.2g,迅速剪碎，放入盛有液氮的研钵进行充分研磨后置于离心管中，加入1L预热至65的DNA提取液，65水浴30min,期间轻缓颠倒混匀2次：12000rpm离心20min,吸取上层清液至2mL离心管，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇混合液(25：24：1)，轻缓颠倒混匀，12000rpm离心10min,取上清液转入新的2L离心管，再加入等体积氯仿重复抽提一次，吸取上清液至新的2L离心管；加入等体积异丙醇，-20
2、静置10min,12000rpm离心10min,弃上清液，70%酒精洗涤2次。常温干燥后加入100LTE溶解，-20保存。DNA质量经0D260/280检测在1.82.0之间方可用于后续试验。上述DNA提取方法为标准推荐使用，在保证DNA提取质量能够符合PCR扩增需要的前提下其它DNA提取方法均可采用。5.3PCR扩增5.3.1SSR引物5对基本核心引物名单见附录B,参照品种R0C22和桂糖11号对核心引物的指纹图谱见附录C。每对引物的上游引物5端用荧光标记。5.3.2反应体系PCR反应体系为20L,其中10 XPCR Buffer(含20mmol/LMg)2L,dNTP(10mmol/L)0
3、.4L,上、下游引物(10mo1/L)各1uL,模板DNA40ng,Taq酶1U。5.3.3反应程序95预变性5min:94变性30s,5065退火30s(退火温度详见附录B),72延伸1min,共35个循环：72延伸5jn,4保存。5.4PCR产物检测5.4.1PCR产物样品准备将荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30倍，从混合液中吸取1L加入到DNA分析仪专用深孔板孔中。板中每个孔分别加入1LGS500分子量内标和10I.去离子甲酰胺。将样品在PCR仪上95变性5min,取出立即置于冰上，冷却10min以上。离心10s后放到DNA分析仪上。5.4.2开机准备打开DNA分析仪，检查仪器工作状态，更换缓冲液，灌胶。将装有样品的深孔板放置于样品架基座上，打开数据收集软件。5.4.3编板按照仪器操作程序，创建电泳板，输入电泳板名称，选择适合的程序和电泳板类型，输入样品编号或名称。2
