1、过继免疫疗法中一颗闪耀的新星CAR-T一.背景介绍1.1.肿瘤的免疫逃逸机制肿瘤的免疫逃逸机制现已表明，机体免疫系统能产生抗肿瘤免疫应答，但是，许多肿瘤仍能在机体内进行性生长，甚至导致宿主死亡，表明肿瘤细胞能够逃避宿主免疫系统的攻击，或是通过某种机制使机体不能产生有效的抗肿瘤免疫应答。肿瘤的免疫逃逸机制是由肿瘤细胞自身的生物学特性决定抗原缺失MHC-I类分子表达低下缺乏共刺激分子免疫抑制“漏逸”2.2.机体的抗肿瘤免疫应答机体的抗肿瘤免疫应答固有免疫应答：NK细胞、巨噬细胞等适应性免疫应答体液免疫：特异性抗体、ADCC效应细胞免疫CD8+T细胞：特异性杀伤CD4+T细胞：分泌细胞因子辅助CD8
2、+TCD8+T细胞对肿瘤细胞的杀伤前提：细胞对肿瘤细胞的杀伤前提：MHC限制性：CD8+T细胞仅能识别表达MHC-I类分子的靶细胞 抗原提呈：正常情况下初始T细胞不能识别任何抗原信息，需要抗原提呈细胞，如DC细胞对抗原进行加工和处理之后呈递3.肿瘤治疗的希望肿瘤治疗的希望过继免疫疗法过继免疫疗法分类分类方法方法代表代表缺点缺点第一类患者体内分离特异性T细胞，扩增后回输TIL时间长、成本高第二类单个核细胞“多克隆化”扩增后回输LAK、CIK、DC-CIK肿瘤特异性T细胞数量有限第三类异体肿瘤特异性T细胞系扩增后回输NK-92、EBV特异性CTL供者有限，安全风险高第四类基因工程修饰T细胞，使其获
3、得特异性TCR-T、CAR-T成本高*现有过继免疫疗法的比较现有过继免疫疗法的比较二.CAR-T嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell,CAR-T)：通过基因工程技术，使能够识别肿瘤特异性抗原的受体表达在其表面的T细胞嵌合抗原受体使得T细胞对肿瘤抗原的杀伤绕过了抗原提呈阶段以及MHC的限制性，使其杀伤活性得到最大化1.CAR的结构和功能的结构和功能 抗体单链可变区（scFv）：识别并结合肿瘤特异性抗原 共刺激区：提供T细胞活化的第二信号，维持T细胞的生存时间 T细胞活化区：提供T细胞活化的第一信号，激活T细胞的增殖信号通路 铰链区：促进抗原受体与肿
4、瘤抗原的结合 跨膜区：固定CAR图示：经典的CAR结构2.CAR-T的制备过程的制备过程T细胞培养传统方法：IL-2、丝裂原、人造APC等重编程法：类似iPSCCAR转染载体CAR启动子信号转导区抗体绑定区加尾信号质粒逆转录病毒慢病毒转座子RNA载体系统载体系统特点特点优势优势劣势劣势逆转录病毒稳定整合使用广泛，安全性研究充分携带DNA片段小某些细胞修饰率低慢病毒稳定整合转导效率高可转染静息T细胞成本高于逆转录病毒某些情况下有遗传毒性DNA（转座子）稳定整合转基因表达高且持久成本低缺乏安全性研究需要转座酶和转座子DNA（质粒）稳定整合制备成本长期体外筛选随机插入风险RNA瞬时表达安全性高表达时
5、间短3.CAR-T的临床研究和应用的临床研究和应用截至目前，Clinical Trials已经注册的有关CAR-T的临床试验有61项，全球分布如下实体肿瘤：早在2006年,全球第一项CAR-T临床试验即是针对实体瘤的。目前，全球已报道了15项CAR-T治疗实体瘤的临床研究,其中大部分采用的是第一代 CAR-T,涉及卵巢癌、肝癌、乳腺癌、直肠癌等。就目前的情况来看，CAR-T在实体肿瘤治疗还未达到理想的效果血系肿瘤：截至目前,已经有47 项 CAR-T临床研究报道了在血液系统肿瘤中的试验结果。其中针对B细胞恶性肿瘤的CAR-T临床试验来说,CAR-T治疗已经取得了一些令人惊喜的疗效。注：CR-c
6、omplete response完全缓解；PR-partial response部分缓解思考：临床试验主要集中在血系肿瘤的原因？美国国立癌症中心利用反转录病毒转染的19-28ZCAR-T治疗了30例不同类型的B细胞肿瘤。在27例可评估的患者中有22例获得完全缓解（CR）或部分缓解（PR），最长的CR持续了37个月。宾州大学利用慢病毒转染的19-CD137ZCAR-T治疗B细胞肿瘤的最新临床结果，共治疗了20例儿童及成年人难治复发的B-ALL,CR率达到90%,6个月无病生存率和总生存率分别为67%和78%4.CAR-T临床应用中存在的问题及应对策略临床应用中存在的问题及应对策略 脱靶效应CAR
7、-T细胞攻击与靶细胞抗原相同的机体正常细胞的行为2010年,研究者采用第三代抗 ERBB2 CAR-T治疗1 例结肠癌肝和肺转移患者,1010个细 胞输注后15min内,患者突然出现呼吸困难和肺水肿症状。血清细胞因子检测显示,患者出现了细胞因子风暴特征,细胞输注后,血清 IFN-、GM-CSF、TNF-、IL-6和IL-10 细胞因子水平明显升高。5d 后患者死亡。研究者认为,大量CAR-T输注后立即 累积于肺部,会攻击表达低水平ERBB2的肺上皮细 胞,并释放细胞因子,最终危及患者生命。因此，因此,对于CAR-T疗法来说,重中之重的工作是鉴定出肿瘤真正特异性的细胞表面分子靶标。B淋巴细胞白血
8、病的 CAR-T疗法临床研究结果之所以与其他CAR-T疗法相比较为成功,与B细胞恶性肿瘤细胞较为特异 性的靶标CD19分子的选择不无关系。大量研究表 明,绝大多数B细胞恶性肿瘤细胞表达CD19分子,而正常必需组织不表达CD19,正常组织中CD19的 表达仅限于成熟B细胞、B细胞前体细胞和许多浆 细胞,这就有效降低“脱靶效应的概率,避免抗CD19 CAR-T对人体正常必需组织的免疫攻击然而，目前已鉴定出的肿瘤特异性抗原却非常有限，特别是实体肿瘤，这成为了制约CAR-T发展的重要因素。应对策略一：抑制性应对策略一：抑制性CAR策略策略在这种策略中,在这种策略中,抗原A为 肿瘤非特异性抗原,它同时表
9、达于肿瘤细胞和正常细胞表面,而抗原B仅表达于正常细胞表面。T细胞经过基因修饰同时表达识别抗原A的CAR和识 别抗原B的iCAR,当这种基因修饰的T细胞遇到表达抗原A 和 B 的正常细胞,由于来自 iCAR 中的 PD-1或CTLA-4胞内区T细胞抑制信号会削减来自 CAR的T细胞活化信号,导致这些基因修饰的T细 胞不能被活化,进而无法攻击这些正常细胞。应对策略二：组合抗原识别信号平衡策略应对策略二：组合抗原识别信号平衡策略在这种策略中,抗原A和B为肿瘤非特异性抗原,它们同时 表达于肿瘤细胞表面,而抗原A和B不同时表达于正常细胞表面。此时将针对抗原A和抗原B的CAR进行改造，即针对抗原A的CAR
10、仅提供活化第一信号，抗原B的CAR仅提供活化的第二信号，那么此时无论T细胞接触到A-B+或是A+B-的正常细胞时，自身都无法充分活化，而失去对正常细胞的攻击性。细胞因子释放综合症（CRS）CRS是一种常见的现象与T细胞治疗过程中一种常见现象。当输液到患者的T细胞扩增，同时释放细胞因子，引起全身症状，如发热，恶心，寒战，低血压，头痛和皮疹，等等。CRS不能完全防止，事实上，CRS的是在治疗过程中的并发现象。然而，CRS严重的情况下，可能造成较大的副作用，因此需要治疗干预，缓解并发的治疗的毒副作用2014年4月，由美国斯隆-凯特琳癌症中心主导的一项关于利用CAR-T治疗非霍奇金氏淋巴瘤的早期研究因
11、出现患者死亡事件而被迫暂停。主要原因是进行CAR-T细胞治疗过程中发生的CRS所致。应对策略一：激素类药物抑制已激活的应对策略一：激素类药物抑制已激活的T细胞活性细胞活性同样在移植物抗宿主病中使用到的甲基泼尼松龙，这类药物能直接抑制激活的 T 细胞活 性,并已经用于治疗移植物抗宿主病。但是,该策略 的弊端在于无法豁免CAR-T细胞,在抑制炎症反应的同时,也会终止CAR-T细胞的抗肿瘤活性,导致治疗失败应对策略应对策略二：靶向阻断水平升高的二：靶向阻断水平升高的细胞因子的信号转导细胞因子的信号转导以CRS中水平上升最为显著的IL-6为例,可以采用托珠单抗特异性与细 胞表面IL-6受体结合来有效阻
12、断IL-6 信号转导途径，更为重要的是,托珠单抗不会损害CAR-T的抗肿瘤活性应对策略三：引入自杀基因，清除应对策略三：引入自杀基因，清除CAR-T在CAR-T 中引入“自杀基因”,一旦CRS被检测到，对患者使用该基因对应的前体药物,会使表达该基因的CAR-T 细胞被选择性清除,避免CAR-T 细胞潜在的毒性反应例如，向CAR-T中引入胱氨酸蛋白酶9（iC9）基因，然后再使用AP1903进行治疗，则CAR-T会在一小时内被选择性清除 艰难的商业化道路CAR-T 疗法是一种“个性化”疗法,细胞制品仅适用于患者自身,无法“现货供 应”,只能“现用现做”。这也意味着CAR-T制备成 本会比较昂贵,这
13、对于有意涉足的制药企业来说,完成FDA要求的一 系列、和期临床试验的投入成本将是巨大的但即便如此，一些药企，如诺华和辉瑞等7家制药企业已然迈出了试探性的一步，因为正如一位研究者所说：我们并不在乎是否投入5 亿美金去开发第一瓶药,只要我们能以1美金生产出第二瓶药基因工程和细胞工程技术的联合使用，为过继免疫疗法带来了新的思路。嵌合抗原受体现在已经不仅仅用于被修饰T细胞成为，CAR-T，它也可以被用来修饰NK细胞和CIK细胞，成为CAR-NK和CAR-CIK，充分发挥CAR和修饰细胞的优势作用德国波恩大学的研究人员从结直肠癌患者外周血中采集和培养CIK细胞,并利用CEA+抗体特异性的CAR对CIK细
14、胞进行改造,使CIK细胞获得CAR的特性。将CAR-CIK细胞与CEA+肿瘤细胞共培养后,发现其分泌的IFN-,要高于与CEA-肿瘤细胞共培养情况;而用未改造的CIK细胞与CEA+/CEA分别共培养,却未观察到IFN-分泌增加,且CAR-CIK细胞的细胞毒效应也比未改造的CIK细胞要高三.CAR-T技术的拓展四.未来的发展方向寻找肿瘤特别是实体肿瘤特异性标志更便捷安全的转染方法调控CAR-T活性的方法-避免CRS更多类免疫细胞CAR化2014年12月6-9日在旧金山举行了第56届ASH（美国血液病学会），对于CAR-T，提出了以下观点：多个中心尝试开发通用型CAR-T,即釆用正常异体来源的T细
15、胞。通过敲除内源性TCR基因以排除同种异体TCR导致的移植物抗宿主病（GVHD），且能进一步提高CAR-T的杀肿瘤效率。这种策略显著拓宽了CAR-T的细胞来源，避免因患者自体T细胞因数量低、功能不充分、扩增能力差等限制应用。第三方细胞来源的CAR-T还具备易于操作、重复性好等优势，更有利于大批量临床应用 针对单个靶标的CAR-T治疗时肿瘤复发或无效问题，一些中心开发出多靶标的CAR-T,临床前实验显示出更强的抗瘤效应 以往的研究报告更多用自体CAR-T联合化疗降低肿瘤负荷，以提高缓解率。而本次ASH会议上，报告了在同种异体造血干细胞移植（allo-HSCT）后复发的患者中，通过供者CAR-T清除免疫残留的探索及其应用意义。allo-HSCT后回输供者的CAR-T可有效防治白血病复发，并避免了自体肿瘤细胞污染。而且供者来源的未转染T细胞还能清除受者体内丢失了CD19抗原的肿瘤细胞，可防止因肿瘤抗原逃逸导致的复发 目前报道的CAR-T临床前或临床试验都是用成熟T细胞改造成的CAR-T,通常在体内持续时间短，而限制临床效果并易导致肿瘤复发。几个研究中心开始探索将造血干细胞基因修饰成CAR-T的可行性，这种CAR-T可持续存在于体内（可达35周）并可分化成多系别靶标特异性的免疫细胞Thank you！
