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抗坏血酸过氧化物酶活性测定的探讨-沈文飚.pdf

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资源描述

1、E vm(a:)。由于。值也受劝。的影响,并不是 一个常数,只有在叭较大 时砷p/如ma x)、1,。、一日,才是一个 恒定值。因此,在判定细胞壁弹性大小和弹性调 节 能力 强 弱时,最理 想 的参数是回归系数日值。3BtaekT J,Bevila equaE,Z wiaz ekJ J.E f feetsofrelx,ate dstres so ntu rso rPre ssu reandeel叉ela stieityehans 8inbla eksPr ueesee dling s.八砚1加咧价eh口。剐翔公o f山尹 汉动J,1991,9:132 9参考文献王 万里.压力室在植 物水分状况

2、 研究中的应用.枝物生理学通讯,15.4(3):5 2a BrkerD J,SullivianC Y,Mo serL E.Wate rdef ieiteffeetso no smotieo pte ntial,e ell walle生a stieity,a ndProlin einfiv efo r agegrass e s.A习臼月尹。刀,199 3,2:2704Edu a rdJStadeIma nn.T hederiv ationoftheeellwallelastie-ityfunetionfr omthetu rgo r因tential二Ix E夕及龙,1984,3 5:85 95J

3、on e sM M,Tu r nerN C.O SmotieadJustmentinleave sof月乳万户朋inresp on setowarerdef ieits.产忆必“黝引盆以,19 78,61:1 2 26RiehterH.Adiagr umfo rthede seri Ptionofwaterrelatio nsinPla ntc ellsandor即n s二I艇尹及龙,19 7 8,29,11 9 7植物生理学通讯产 饭刀“了询占汉恻凸川己叔19 96,32(3),203一2 05抗坏血酸过氧化物酶活性测定的探讨沈文庵徐朗莱叶茂炳张荣铣(南京农业大学,南京:1。0 95)Stu

4、dyonDeterminationofAS PAetivityS H E NWe n一Biao,X ULang一Lai,YEMao一Bing,zH AN GRong一Xian(入hn7矶夕月少砚。“z从八“l尸。威夕,人砚了呷2 10 095)抗坏 血 酸 过 氧 化 物酶(as e orbateperoxi-da se,Ecl1 1l11,AS p)是以抗坏血酸 为电子供体的专一性强的过氧化物酶.s,主要 存在于 植物 叶绿体和胞浆中仁3,了三,一般用 愈创 木酚作为电子供体测 定 酚特异性过 氧化物酶(PPOD)的方 法不能 测出其 大部分活性。它 和超氧化物歧化酶(SOD)、过 氧化氢酶

5、(CAT)、单脱氢抗坏血酸还原酶(MDARD)、双脱氢抗坏血 酸还 原酶(D H ARD)以及谷 肤 甘 肤 还 原酶(GR)一起 构 成 了活性氧清 除 系统 中的 酶系 统,且A S P目前被 认为是 叶 绿体 中清 除H202的关键酶s ,91。迄 今 为止,国内还没有文献 具体报 道 其 活性测定方法,本文 主 要介 绍一种 用记录仪和分光 光 度计相 连接来测 定As P活性的方法,并 探讨 了不同 的酶提取 液对As P活性的影响。材料与方法供试材料盆栽小麦(外“,、ma e s t”。m)品种为扬麦5号 和野生一粒(T.灰八义。m)。仪器 组装参照徐朗莱等的方法。将上海 大华仪表

6、厂生产 的XwT一16 4型台式自动平衡记录仪的 讯号插 头线路与日产岛津U V-收稿l19 9 5一06一23修定19 9 6一01一08国家攀登汁划资助项目。203DOI:10.13592/ki.ppj.1996.03.016120一02分光 光 度计的记录 器(reeorder)连接起来,或将平衡记录 仪 的信号线以并联 方式连接到上海分析仪器厂 生产的7 21型分光 光度计的微安表上。A S P活力测 定参照D a lto n等s 的方法,并加以改进。取鲜重为19左右的小麦叶片,加5 ml酶提取 液(5 0mmol/LP邵,pH7.8,2m mol/LAsA,5m mol/LEDT A

7、,现 用 现 配),于冰浴中充分研磨匀浆,冷冻 离心(1 00 00义g,2 0m i n),得上清酶液sm l左右,置冰浴中待用。3ml反 应 液中含50m mo一/LP璐,pH7.0,0.1mmol/LEDTA,0.1m mol/LH20:,.0sm m o lL/s AA,最 后 加 入适量酶液 启动反应,连续记录测定室 温下2 90nm吸收值的变化。以不加HZoZ作为对照,HZoZ本身对AsA的氧 化作用在测 定时 间 内由于吸收值变化太小可忽略不计。室 温 下每分钟氧化1件mo fAsA的酶量作 为一个酶活性单位(u)(吸光系数为2.8m mol/LCm)。吸收值的下降来测 定该酶活

8、性叫。室温下分别取20、通o、6 0、80、100、l的酶液进行活性测定,结果见图2。计算活性,分别得0.0 253 6、0.05 318、0.077 1 4、0.106 38、0.1 257 1AZ。/min,其活性之比为l,2.09 68:3.04 1 5:4.194 4:4.9 5 6 5,基本与所 加酶液体积数之比1:2:3:4:5相近,3.02.52.0澎叙1.5督259nm25 02 602 7 02 80波长(nm)29 0300|Le e.L4 0n甘O1 1n,胜五O图1ASP反应介质的紫外光谱吸收加卯加恤办月h又结果与讨论研 究结果表明,反 应介质的最 大 吸 收峰在2 5

9、 9nm处(图I),考虑 到 在2 59nm处光吸收值太 大,一 些诸如核酸、氨基 酸等物质在2 60和 2 80nm附近的高吸收值干扰以及 连续记录 测 定 的方便性,因此,采用29 0nm处0.920.900.88吕0.8 60.8 40.8 20.8 010加l下111010203 0反应时 间(s)图2AS P粗酶液体积与其活性的关 系表l不同 提取介质对小麦扬麦5号和野生一粒ASP活性的影响Asp相对活性(%)品种对照23对照,扬麦5号1 2 6.5士1 1.606 6.9士1.9 00131.7士0.006 9.5 2士0.386 7.48士0.0 0野生一粒10 010 0101

10、.4士5.6 03 5.5士1.30010010 01 4 2.7士9.5 86 8.4士6.7142.8 5士5.00对照:5 0 mmol/LP邵,pH7.8;l:5 0mmo一/L PB S,pH7.8,2 m mo一/LAsA,5m mol/LE D T A;2:50mmo一/LP邵,p H7.8,m mol/LD T T,l%PvP;3:5 0r n mol/LPB S,P H7.8.5 mmol/LDTF,l%PVP。对照:10 0m mo一/LTris一H cz,pH7.0;1:10 0m mol/LTris一H C I,p H7.0,0.2mmol/LAsA,5m mol/LE

11、DTA;2:10 0mmo一/LTri、一He 一pH7.0,0.5m mo一/L EDTA,0.5mmo一/L卜琉基乙醇,一%PvP;3:10 0m mo一/L Tris一HC一,pH7.0,0.5mmo一/LEn TA,1mmo一/L卜一琉基乙醇,l%PvP。2 04相 关系数为0.9 9 831。由上可知,每m l酶液抗坏血酸过氧化物酶活性为1.2709 1A29。/mi n或45 3.gu,此外用上述酶液测定A S P活性6次,变异 系数为1.55 7%(具体数值略),可见,连续记录测定法实验偏差的批 内变异系数在允许值范围内。尽管小麦粗酶液中抗坏血酸氧化酶的活性较低,但考虑 到实验的

12、准确性,做对 照是必要的。由于测定反应是通过检测 反应底物s AA的降低来计算酶活性,所以所加酶量一般也不宜过大,宜使加液量控制在产 生 的A2 9。吸光值下降在408内呈 良好的线性关系。由于连续记录测定法把吸光值变化直接记录于纸上,使之非常清楚,不仅免徐了定时读数的麻烦,更重要的还 在于可以直接准确地测定酶反 应的初速度。为了探讨不 同 的酶提 取液对As P活性的影响,实验以扬麦5号、野 生一 粒的旗叶(全展,1 0d)为材料,采用8种提取介质(分两组)z 重复3次,分别测 定ASP活性,结 果见表1,酶活性单位为A2 9。/mi n9Fw。试验表明,在酶提取液中加有As A的,其A S

13、 P活性都高于对照,最高可超过4 0%;相反,酶提取液 中加有D T T或卜琉基乙醇,无论浓度是多少,A sP活性都明 显低于对照,加了5m m o f/LDT T的酶提 取液 甚至完 全抑制A s P活性。一般DT T、卜琉基乙醇都是作为琉基基团的保护剂而加入酶提取液中的,但是也有一些酶会被一定 浓 度的DT T、压琉基乙醇所抑制,AsP便是一例比,本实验也证实了上述结论。1至 于抑制机理,h Ce n等川运用电子自旋共振(s ER)技术,认为是 硫醇与样液中少量金属离子反应生成HZOZ,或外加HZ仇测 定As P活性时,硫 醇 会 被As P、HZoZ氧化生成h ti yl自由基,后 者

14、再与A SP反 应 生成oH,从 而使A s P失 活。AsA保护A s P的原因可能是As A氧化产 物 兰脱 氢抗坏血酸 自由基(MDA)对A S P的钝化形 式进行激 活 所致闺,更有可能是AsA可以维持占AS P总 活性 相当高比例 的叶 绿体AS P活性 的 存在s,幻。总之,选择不同的ASP酶提取液,对A S P活性测定影 响较大,所以应选择类似本文中采用的含AsA,而不 含DT T或压琉基乙醇的合适的酶提取液。参考文献徐朗莱,叶茂炳.过氧化物酶活力连续记录测定法.南京农业大学学报,1959,l,:5 2梁承邺,陆贤丰.水稻不育系与其保持 系花药中的内源多胺和抗氧化代谢.植物生理学

15、报,19 9 3,l。(l):52C henG X,Aa s血K.Aseo rbatep er oxida seinteala eve s:),-e ut tenc eoftwo生 sozyme sandthed if fereneesintheirenzy-matica ndmolecula rpr o伴rtie s尸翻之 减h P梦“,19 89,30(7):987C henGX,Aa sdaK.Ina ctivationofasco ra btep eo rxida sebyt址015require shydro sen伴roxide.2吻川威尸匆“,19 9 2,33(2):1 17D

16、alto nDA,HanusF J,Rus sell S A戌己.Pu rif ic atio n,Pro-Pe rtie s,anddistributio nofa se o rh atep er oxida seinlegumero otno dule s.了 忆”“产为饭定,1987,8 3:78 9H姆s ainMA,Aa sdaK.In a etivationofa se o ra btep ero xida seinsPina cheh lo r oPla stsonda rk时d itionofhydr oge np er o xi-de:ItsPr otectio nbya se o ra bre产 怕刀“巴左 尸甸戚义,198 4,25(7):1 28 5MiyakeC,Aa sdaK.Thylakoid一o bunda s c orbatep er oxida seinsPina eheh lo r oPla stsa ndPhoto rd euetio nofitsPrima ryoxi-d ationPro duetmono dehydro a seor加ter

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