1、讨论与建议ITS序列分析及其在植物真菌病害分子检测中的应用赵杰(西北农林科技大学 植保学院,陕西 杨凌712100)提要:近年来,利用PCR扩增病原菌核糖体ITS(internal transcribed spacer)基因区段进行病原菌鉴定、检测及病害诊断技术得到了发展,利用病原菌在rDNA的ITS区段既具保守性又在科、属、种水平上均有特异性序列的特性,对ITS区进行PCR扩增、测序及序列分析后再设计特异性引物来诊断和检测植物病原菌,尤其是植物病原真菌的分子检测已越来越被广泛应用。关键词:rDNA-ITS;病原真菌;分子检测近年来,利用PCR扩增病原菌核糖体ITS(internal tran
2、scribed spacer)基因区段进行病原菌鉴定、检测及病害诊断技术得到了发展79。由于这种方法快速、准确和简便,因而,越来越受到植物病理学家们的重视。本文就ITS在植物真菌病害分子检测中的应用作一简述。1ITS及其引物核糖体内转录间隔区(Internal transcribedspacer,ITS)位于rDNA?rRNA片段上,包含两个不同的非编码区域,即ITS1和ITS4。ITS序列在物种属内、近缘属间及至科内系统进化关系研究中有一定的价值。真菌核糖体基因(ribosomalDNA,rDNA)由小的亚单元(18S)、ITS1区、5.8S区、ITS2区和大的亚单元(28S)构成(图1),
3、头尾串联形成重复序列,一个基因组内有60200个拷贝。真菌ITS区域长度一般在650750 bp(碱基对)。rDNA多复制的特性,有利于低浓度或被更高度降解的DNA样品中ITS区域的扩增。图1ITS区段PCR扩增引物示意W hite等为真菌rRNA基因的ITS设计了3对特异引物,即ITS1、ITS4、ITS5,用于大多数担子菌和子囊菌1;不过这些引物也能扩增一些植物ITS区域2。在ITS应用中,设计和选用特异性的引物显得非常重要。ITS1-F和ITS4-B是Gardes等为真菌和担子菌分别设计的特异引物3(表1),能显著提高特异性。M armeisse等还为外生菌根粘花茹属(Hebeloma)
4、的真菌及菌株鉴定设计并合成了特异引物5。引物ITS1和ITS2用于扩增18S rDNA和5.8S rDNA之间的转录间隔区ITS1,引物ITS3和ITS4用于扩增5.8S rDNA和28S rDNA之间的转录间隔区ITS26。2在植物病原真菌分子检测中的应用利用病原菌在rDNA的ITS区段既具保守性又在科、属、种水平上均有特异性序列的特性,对ITS区进行PCR扩增、测序及序列分析后再设计特异性引物来诊断和检测植物病原菌,尤其是植物病原真菌的分子检测已越来越被广泛应用10(表2)。532004(4)陕西农业科学收稿日期:2004-06-22表1用于扩增真菌ITS区域的几种常用引物引物序列(53)
5、位置参考文献ITS1TCCGTAGGTGAACCTGCGC18S3ITS1-FCTTGGTCATTTTAGAGGAAGTAA18S3ITS1-R(TA)TGGT(CT)(AGT)(TC)(TC)TAGAGGAAGTAA18S4ITS5GGAAGGTAAAAGTCAAGG18S2ITS4TCCTCCGCTTATTGATATGC28S2ITS4-BCAGGAGACTTGTACACGGTCCAG28S3ITS4-RCAGACTT(GA)TA(CT)ATGGTCCAG28S4表2植物病原真菌的ITS分子检测病原菌检测物目标rDNA位置文献R hizoctonia solaniR.oryzae&R.or
6、yzae-sativae水稻叶ITS区R hynchosporium secalis大麦种子ITS区Phy tophthora inf estansP.ery throsep tica&P.nicotianae马铃薯块茎ITS区Gaeum annomyces gram inis小麦病组织18S区M ycosphaerella m usicolaM.f ijiensis叶或病原菌保守区和ITS区V erticillium albo-atrumV.dahliae棉花病部或病菌孢子ITS区10Phy tophthora spp.病菌DNAITS区L ep tosphaeria m aculans叶保
7、守区和ITS1区L accaria spp.根或病原菌ITS区Glom us vesiculif erum根或病原菌18S区Glom us intradicesGigaspora m argarita树脂上的病原孢子18S区Colletotrichum acutatum草莓叶ITS1区Colletotrichum gloesporiodes番茄果实ITS1区Parasitica var.nicolianae烟草病组织、土壤ITS区12T illetia indica病原菌冬孢子ITS区13P lasm odiophora brassicae病原菌ITS区11Phy tophthora boeh
8、m eriaeP.cactorum病原菌ITS1区6杨佩文11等应用真菌核糖体基因ITS区段通用引物ITS1和ITS4,对十字花科蔬菜根肿病菌(P lasm od iophora brassicae)rDNA进行PCR扩增,测序分析和特异引物的设计,获得根肿菌一特异性分子片段并对不同寄主植物进行了检测。谢勇12等根据从GeneBank database获得的疫霉属真菌(Py tophthora spp.)rDNA ITS区段序列,设计合成了烟草寄性疫霉的特异性引物,并从不同病组织及土壤中均检测到烟草寄生疫霉,而参试的其它菌株交链孢菌菌株、镰刀菌菌株、炭疽菌菌株、立枯丝核菌菌株、稻瘟病菌菌株和野
9、火病菌菌 株 均 没 有 扩 增 产 物。张 竞 宇13等 根 据GeneBank中登录T illetia属的20个种的ITS序列差异设计1对引物T I?T2,然后利用ITS区通用引物ITS1?ITS4与T1?T2组合,线粒体引物T i1?T i4与线粒体差异引物M 1?M 2组合建立的63陕西农业科学2004(4)套式PCR反应体系,直接将小麦印度腥黑穗病菌(T.ind ica)与其他相似或相关种区分开,且灵敏度可达1个孢子。N azar等针对棉花黄萎病菌V erticilliumspp.运用ITS区通用引物进行PCR扩增,获得了区分V.albo-atrum和V.dahliae两个种的特异性
10、序列,设计并合成了特异性引物对两者进行了检测。利用L eptosphaeriamaculans的ITS区段的序列可以将其强致病菌株和弱致病菌株区分开来,并且可以在病害症状显现之前检测到强致病株。同时,通过PCR技术可以定量地检测病原菌的数量,Robb通过定量PCR技术很好地监测到受病原菌V erticilliumspp.侵染的寄主植物上该病原菌的数量。这些技术在病害研究中的应用,不仅能准确地监测病菌,更重要是,它的运用将是对病害发生流行进行预测预报的一种强有力的工具。对于锈菌等严格专性寄生菌,因为它们只能在活体上进行寄生和繁殖,不能人工进行离体培养,所以从寄主植物上直接进行PCR来及早而准确地
11、检测病原菌,将更有实际意义和广阔的应用前景。除此之外,美国植物病理学工作者还针对核糖体内转录间隔区(ITS)设计了不同病原菌的特异性引物。如5585238号专利分别设计了S ep to2ria,Pseudocercosporella和M ycosphaerella的特异引物,5800997号专利设计了Puccinia,Cer2cospora,H elm inthosporium和K abatiella的特异性引物。3展望迄今为止,植物病原真菌的分类鉴定主要依据其营养体和子实体的形态特征,由于形态特征容易受到培养条件和其它因素的影响,而且许多子实体类型经常难以获得,故给鉴定工作带来困难。然而真菌
12、DNA的碱基组成具有遗传稳定,不易受环境影响,而且在生活史任何阶段均可获得。而ITS区域在不同菌株间存在丰富的变异,对ITS区进行序列分析不仅丰富了真核生物核糖体基因ITS的序列信息,为病原菌的分类鉴定及系统发育等研究提供了十分重要的资料和依据,而且为建立病原菌的分子监测与疫病的快速诊断技术奠定了基础,对植物病害的防治具有一定意义。参 考 文 献:1Sm ith S E,Read D J,mycorrhizal symbiosis.2nd edition.Cambridge:Academ ic Press,1997,126160,255,289.2W hite T J.Bruns T,Lee
13、S.Analysis of phytogenetic rela2tionships by amplification and direct sequencing of riboso2mal RNA genes.In innis M A,ed.PCR Protocols:AGuide to M ethods and Applications.New York Academ ic,1990,315322.3GardesM,Bruns T D.ITS primerw ith enhanced specifici2ty for basidiomycetes:Application to the ide
14、ntification ofmycorrhizae and rusts.Mol Ecol,1993,2:113118.4GardesM,Bruns T D.ITS-RFLP matching for identifi2cation of fungiA.In:Clapp J P,ed.SpeciesDiagnosticsProtocolC.Totowa,New Jersey:Humana Press,1996,177186.5M armeisse R,Dehaud J C,Casselton L A.DNA probesfor species and strain identification
15、in the ectomycorrhizalfungus HebelomaJ.M ycological Research,1992,96:161165.6王源超,张正光,郑小波.核糖体基因ITS作为苎麻疫霉、恶疫霉分类辅助性状的研究J.菌物系统.2000,19(4):485491.7Schubert R,Bahnweg G,Nechwatal J,et al.Detectionand quantification of Phytophthora species which are asso2ciated w ithroot-rot diseases in European deciduousf
16、orests by species-specific polymerase chain reaction.EurJ for Path,1999,29:169188.8Bonants P,W eerdtMH,Lacourt I,et al.Detection and i2dentification of Phytophthora fragariae by the polymerasechain reaction J.European Journal of Plant Pathology.1997,103:345355.9Volossiouk T,Robb EJ.Nazar RN.Direct DNA extractionfor PCR-mediated assay of soil organism s.Applied andEnviromentalM icrobiololgy,1995,61(11):3 9723 976.10方正.小麦纹枯病菌的多样性和分子检测.扬州大学硕士论文.2003.11杨佩文,李家瑞,杨勤忠等.根肿病菌核糖体基因ITS区段的克隆测序及其在检测中的应用J.云南农业
