1、细菌分类鉴定方法的研究进展目录细菌分类鉴定方法的研究进展4摘 要4ABSTRATC51、引言51.1细菌分类鉴定51.1.1 细菌常规鉴定方法51.1.2细菌的数值分类和自动化鉴定61.1.3化学分类鉴定法61.1.4分子遗传学分类鉴定法61.2细菌分类鉴定方法的前景6细菌的鉴定方法的介绍与总结71、细菌常规鉴定方法71. 1 免疫诊断技术71. 1. 1 凝集试验71. 1. 2 免疫酶技术71.1. 3 免疫荧光技术71. 1. 4 放射免疫测定技术71. 1. 5 免疫胶体金标记技术71. 2 蛋白质图谱分析72、细菌的数值分类和自动化鉴定83、化学分类鉴定法83.1 磷脂脂肪酸分析技术
2、（PLFA）6832 高效液相色谱（HPLC）783.3 气相色谱（GC）784、分子遗传学分类鉴定法94. 1 细菌染色体DNA G+ C mol %含量测定94. 2 核酸杂交技术94. 3 限制性核酸内切酶分析法94. 4 质粒图谱分析法94. 5 脉冲场凝胶电泳分析法94. 6 PCR技术94. 7 16SrRNA 序列和16S23SrRNA 间区序列分析法104. 8 微生物全基因组测序106、参考文献10细菌分类鉴定方法的研究进展摘 要细菌分类鉴定方法包括表型鉴定法和分子遗传学鉴定法两大类,分成4个水平:细菌形态和生理生化水平、细胞组分水平、蛋白质水平和核酸水平。表型鉴定法是对前3
3、个水平的鉴定,包括常规鉴定法、数值分类鉴定法和化学分类鉴定法。分子遗传学鉴定法1是核酸水平的鉴定,对细菌染色体或质粒DNA 进行分析,核酸杂交、PCR 技术、16SrRNA 和16 23SrRNA 序列分析、全基因组测序等,此类方法使细菌种属定位和亲源关系判别由表型特征深化为基因型鉴定。本文主要来介绍各种分类方法以及每种方法的优缺点。关键词：细菌分类鉴定 表型鉴定 分子遗传学鉴定Bacterial classification and identification of the research progressABSTRATCBacterial classification and iden
4、tification method two categories, including the the phenotype identification method and molecular genetic identification method is divided into four levels: the bacterial morphological and physiological and biochemical level, the level of cellular components, protein level and the nucleotide level.
5、The phenotypic identification law is the identification of the first three levels, including conventional identification method, numerical classification and identification and chemical classification identification method. Identification of molecular genetics method 1 is the identification of the n
6、ucleic acid level, analysis of the bacterial chromosome or plasmid DNA, nucleic acid hybridization, PCR, 16SrRNA and the 16 23SrRNA sequence analysis of whole-genome sequencing, such positioning method bacterial species and phylogenetic discrimination by the deepening of the phenotypic characteristi
7、cs of genotyping. This paper is mainly to introduce the various classification methods as well as the advantages and disadvantages of each method.Key word ：Bacterial classification and identification Phenotypic identification Molecular genetic identification1、引言1.1细菌分类鉴定1.1.1 细菌常规鉴定方法细菌常规鉴定法是细菌形态和生理
8、生化水平及蛋白质水平的鉴定,前者是最经典、最常用的分类鉴定指标,也是现代化分类鉴定的依据,后者包括免疫诊断技术、蛋白质图谱分析和氨基酸序列分析等。1.1.2细菌的数值分类和自动化鉴定目前应用较多的自动化鉴定系统主要有:Vitek - AMS(Automated Microbic System) 2 、Biolog、MicroScan 、Entero2tube 、MIDI、Sensititte 、Autosceptor 、Crystal 等鉴定系统。数值分类法是近20 年来发展起来的细菌分类理论,它应用大量已知菌对相关生化试验反应出现的频率得出数据进行分析,优化组合数10 项生理生化指标集合成套
9、试剂,根据相似系数大小判断细菌种属间的亲源性。自动化微生物鉴定系统即采用数值分类原理。微生物数值分类鉴定集数学、电子、信息及自动分析技术于一体,具有系统化、标准化、微量化和简易化等优点,采用商品化的鉴定测试卡,将未知菌鉴定到属、种、亚种或生物型,可不同来源的临床标本进行针对性鉴定,所得结果以数字方式表达,与数据库数据(手册或软件) 对比得出鉴定结果。1.1.3化学分类鉴定法20 世纪50 年代中期由Cummins 和Harris 建立起来的化学分类鉴定法3主要通过细菌细胞壁化学成分即氨基酸和糖的分析进行分类鉴定,属的分类主要测定各种氨基酸组分,种的鉴定主要是对糖的分析。另外,还有全细胞水解液糖
10、型分析、脂肪酸分析、磷酸类脂成分分析、枝菌酸分析、醌类分析和光合色素成分分析等,常使用红外光谱、气相色谱、高效液相色谱和质谱等新技术。1.1.4分子遗传学分类鉴定法分子遗传学分类法是以微生物的遗传型（基因型）特征为依据，判断微生物间的亲缘关系，排列出一个个的分类群。目前较常使用的方法有：细菌染色体DNA G+ C mol %含量测定、核酸杂交技术、限制性核酸内切酶分析法、质粒图谱分析法、脉冲场凝胶电泳分析法、PCR技术、16SrRNA 序列和16S23SrRNA 间区序列分析法、微生物全基因组测序1.2细菌分类鉴定方法的前景每种鉴定方法均有其优点和缺陷,常规鉴定法常出现表型表达不稳定、敏感性不
11、高、测试项目多、费时费力等问题;免疫诊断技术若无相应抗体则无法鉴定;细菌自动化鉴定适于快速鉴定,但目前数据库中模式菌种数量有限,部分细菌只能鉴定至属,对革兰氏阳性菌和厌氧菌的鉴定效果较差;分子遗传学鉴定是从本质上阐明细菌间的亲源关系,但所需试剂和仪器昂贵,鉴定时间较长,专业性强,适于科研上的细菌分类研究,不适于基层和临床微生物的快速鉴定。因此,细菌分类鉴定必须同时使用几种方法或系统全面鉴定,表型鉴定和分子遗传学鉴定结合可对未知菌进行准确合理定位,目前应充分利用和完善现有鉴定技术,继续积累核酸数据库资源,研究和推广新的分子遗传学鉴定法,使其在敏感性、特异性和实用性上更适合细菌快速准确鉴定的需要,
12、使其发挥应有的和更大的作用。随着细菌鉴定方法的不断建立和完善,将为科研和临床工作者提供简便、快速、准确、微量、灵敏和成本低廉的检测方法和更先进、更全面的检测手段。细菌的鉴定方法的介绍与总结1、细菌常规鉴定方法1. 1 免疫诊断技术1. 1. 1 凝集试验目前常用的是葡萄球菌协同凝集试验(SPA - CoA) ,金黄色葡萄球菌细胞壁的A 蛋白(SPA) 能与动物血清中IgG的Fc 结合,成为致敏的颗粒载体,特异性IgG的Fc 与SPA 结合后, F ( ab) 2 段暴露在葡萄球菌表面,与相应细菌反应呈现凝集现象,此法用于细菌快速鉴定和分型。1. 1. 2 免疫酶技术免疫酶技术( EIA , E
13、nzymeimmunoa2ssay) 是将酶标记的抗抗体与抗原抗体复合物结合形成抗原- 抗体- 酶标记抗抗体复合物,加入酶底物产生有色产物。以酶联免疫吸附测定( ELISA) 和斑点酶联免疫吸附技术(Dot - ELISA) 应用较广泛。1.1. 3 免疫荧光技术免疫荧光技术( FIA , Fuorescenceimmunoassay) 是将一抗滴加于待检抗原上,再加一抗的荧光抗体(二抗) ,呈现特异性的荧光抗原抗体复合物以鉴定病原菌。此法比ELISA 更直观,可直接观察到菌体形态。1. 1. 4 放射免疫测定技术放射免疫测定( RIA , Rad2ioimmunoassay) 是用放射性同位
14、素标记抗原或抗体,与相应的抗体或抗原结合后通过放射自显影定性和定量抗原或抗体。1. 1. 5 免疫胶体金标记技术胶体金是继酶、荧光素和放射同位素后免疫标记技术中令人瞩目的新标记物。胶体金是氯金酸(HAuCl4) 在还原剂如白磷、枸橼酸钠等的作用下,聚合成特定大小的金颗粒,通过静电作用与抗体或抗原形成一种稳定的胶体状态,即为免疫金,免疫金与相应的抗原抗体结合后,呈现特定的颜色反应。1. 2 蛋白质图谱分析蛋白质图谱分析主要采用聚丙烯酰胺凝胶电泳( PAGE ,Polyacrylamide Gel Electrophoresis)和SDS - PAGE。聚丙烯酰胺凝胶是单体丙烯酰胺(Acr) 和N
15、 ,N- 亚甲双丙烯酰胺(Bis) 在催化剂过硫酸铵和加速剂四甲基乙二胺(TEMED) 作用下聚合为含酰胺基侧链的脂肪族长链,相邻长链通过甲叉桥连接形成三维网状结构物质,PAGE 根据电荷、形状和分子大小分离和定性、定量分析蛋白质和多肽。SDS - PAGE 根据分子量的不同分离蛋白质,SDS 是一种阴离子表面活性剂,与蛋白质疏水部分结合使蛋白质带大量负电荷且使蛋白质的形状趋向一致,抵消了蛋白质本身所带电荷和形状的影响,因此,样品分子量的对数与其在凝胶中的迁移率呈直线关系。2、细菌的数值分类和自动化鉴定法国生物- 梅里埃(Bio - Merieux) 公司的Vitek - AMS系统是应用最普遍的细菌自动化鉴定系统之一,品种齐全,鉴定范围广,可鉴定18 000 多种细菌。它的系列主要有Vitek30 、Vitek60 、Vitek120及半自动鉴定仪ATB expression4全自动鉴定是从接种、培养、读数到报告的全过程自动完成,利用负压将菌液加入测试卡各孔,封口机封口,置孵箱孵育,阅读器以665 nm 波长每小时将测试卡拉出1 次对各
