1、菘蓝体细胞染色体加倍的研究（生命科学技术学院生物* * * ）摘要：利用秋水仙素结合组织培养技术对菘蓝不同外植体（子叶、下胚轴）进行了胚状体诱导和染色体加倍的研究，实验结果表明：1）子叶是胚状体诱导的最佳材料，且在MS+ BAP 2.0 mg/L+ NAA 2.0mg/L培养基中获得的胚状体频率最高。2）低浓度秋水仙素短期处理不会影响子叶胚状体的形成频率，但随着秋水仙素浓度的逐渐升高，子叶所形成的胚状体数急剧下降。3）200mg/L秋水仙素处理6d获得的加倍胚状体植株数最多，其加倍频率达到41.1%。4）当秋水仙素浓度高于500mg/L时将对子叶产生毒害作用，不利于胚状体的形成。关键词：崧蓝
2、秋水仙素 胚状体 染色体加倍菘蓝(Isatis indigoticaFort.)属于十字花科菘蓝属植物,其干燥根医学上称之为板蓝根,具有清热解毒、凉血利咽之功效,医学上用板蓝根治疗伤风感冒、发热、头痛、咽喉肿痛、扁桃体炎、急性腮腺炎、咳嗽痰多等多种上呼吸道感染疾病1。利用组织培养技术人工诱导多倍体，是获得新品种的重要途径之一，方法简单，实验条件容易控制，重复性好，处理植株量大，诱导率高，繁殖快。多倍体药用植物一般具有根、茎、叶和花果的巨型性，抗逆性强，药用成分含量高等特性，这正是药材优质、高产育种所期望达到的目标2。本研究对菘蓝进行多倍体诱导，从秋水仙碱浓度和处理时间对诱导多倍体的效应及多倍体
3、鉴定等方面进行了研究。1 材料、试剂和方法1.1 材料以成熟、饱满、品质优良的去夹菘蓝种子做实验的材料。1.2 无菌实生苗的获得去夹的崧蓝种子用清水冲洗3040min，先用75%乙醇浸泡种子1min，再用20%“84消毒液”溶液浸泡种子10min，然后再用40%消毒液溶液浸泡种子10min，最后用无菌水冲洗35次。接种于不含任何激素的MS培养基上发芽。1.3 确定最佳培养基和最佳外植体将生长旺盛的崧蓝无菌外植体（子叶、下胚轴）分别剪成约0.3cm2 的小块和0.5cm的小段并分别接种于以下含不同浓度激素的MS培养基中，每种浓度5个重复。 CK： MS+ BAP 0.1 mg/L+ NAA 0.
4、1mg/L； 1号：MS+ BAP 2.0 mg/L+ NAA 0.2mg/L； 2号： MS+ BAP 2.0 mg/L+ NAA 2.0mg/L； 3号：MS+ BAP 1.0 mg/L+ NAA1.0mg/L； 4号： MS+ BAP 1.0 mg/L+ 2,4-D 1.0mg/L； 5号：MS+ BAP 2.0 mg/L+ 2,4-D 2.0mg/L。在25、不间断光照下进行愈伤组织的诱导及分化培养。并观察记录不同外植体形成愈伤组织频率以及愈伤组织生长状态3。1.4 确定崧蓝子叶加倍的秋水仙素浓度和处理时间将生长旺盛的崧蓝无菌苗子叶去叶缘剪成0.3cm2小块分别接种于含不同浓度秋水仙素
5、的最佳（2号）培养基中，分别以3d、6d、9d、15d、20d为处理时间变量，每个浓度10个重复，每瓶处理接入10个外植体，进行愈伤组织的诱导分化，秋水仙素处理3d、6d、9d、15d、20d时将正在培养的生长较好的外植体从培养基中取出，移入不含秋水仙素MS+ BAP 2.0 mg/L+ NAA 2.0mg/L的培养基中继续培养。观察统计出不同秋水仙素浓度以及不同处理时间下愈伤组织生长状态4。培养基中激素配比及浓度如下：A号：MS+50mg/L + BAP 2.0 mg/L+ NAA 2.0mg/L；B号：MS+100mg/L + BAP 2.0 mg/L+ NAA 2.0mg/L ；C号：M
6、S+200mg/L + BAP 2.0 mg/L+ NAA 2.0mg/L；D号：MS+500mg/L + BAP 2.0 mg/L+ NAA 2.0mg/L。1.5 不定苗的生根、染液配制及染色体倍性确定1.5.1 不定苗的生根将长势良好的胚状体分离接入生根培养基（MS+IBA0.4mg/L）中培养，25不间断光照，观察诱导生根情况，待根长至1cm左右时进行根尖染色体倍性检查。1.5.2 染液配制取3g碱性品红溶于100ml70%酒精中（可长期保存）配制成A液，B液:取10mlA液加入90ml5%的碳酸酚（苯酚）水溶液中，两周内使用。C液：取55mlB液加6ml冰醋酸及6ml福尔马林。D液：
7、取C液20-30ml加70-80ml45%冰醋酸和1.8g山梨醇，两周后使用。1.5.3 染色体倍性确定撕取不定芽叶片下表皮检查气孔保卫细胞中叶绿体个数。切取根尖于卡诺固定液中固定1d，弃固定液后用水冲洗，然后加1N HCl并于60水浴锅中水浴810min，切取根尖放于载玻片上，滴加染液后压片观察计数细胞分裂中期染色体数目5。1 结果与分析2.1 崧蓝胚状体的形成培养34天后，多数子叶开始膨大，无愈伤现象，但可观察到少量胚状体（图1）。而下胚轴两端膨大，并无胚状体产生。随着培养时间的延长，子叶产生更多胚状体，但在4号（MS+ BAP 1.0 mg/L+ 2,4-D 1.0mg/L）和5号（MS
8、+ BAP 2.0 mg/L+ 2,4-D 2.0mg/L）中始终没有胚状体，只有愈伤组织。十天后下胚轴才出现少量胚状体，生长势不强。子叶和下胚轴均无根出现。30d后在CK中出现几条根（表1），表明低浓度的NAA可诱导生长旺盛的胚状体并产生少量的根。表1 不同处理下外植体生长情况天数 1号 2号 3号 4号 5号 CK4d 叶片膨大 叶片膨大较明显 叶片膨大较明显 叶片膨大 叶片膨大 叶片膨大10d 少量丛生芽 大量丛生芽 大量丛生芽 边缘黄绿色颗粒状 同4号 少量丛生芽18d 部分芽褐化 极少数芽褐化 大量芽褐化 大量褐化、死亡 同4号 少量褐化30d后 大量褐化 生长较好 褐化严重 几乎全
9、部死亡 几乎全部死亡 出现须根 BA 图1. 二号和四号培养基诱导的胚状体和愈伤组织 A： 2号 MS+ BAP 2.0 mg/L+ NAA 2.0mg/L诱导的胚状体；B： 4号MS+ BAP 1.0 mg/L+ 2,4-D 1.0mg/L诱导的愈伤组织 2.2 不同激素对菘蓝子叶及下胚轴胚状体诱导频率的影响不同外植体的胚状体及根的产生时间不同，子叶一般3d左右就会膨大，10d左右已经有大量胚状体分化，30d左右有少量根分化；下胚轴10d左右才有膨大组织出现（图2）。不同激素配比及激素的不同浓度对菘蓝子叶及下胚轴胚状体诱导的频率具有显著的效应, NAA与BAP组合能够有效诱导菘蓝子叶胚状体的
10、形成，并随着两者浓度的升高胚状体频率有逐渐增加的趋势，并于NAA、BAP均为2.0mg/L时胚状体频率最高（58.57%）。而2, 4-D，BAP的组合能够诱导愈伤组织的产生,最终没有分化出胚状体。另外，在含有2，4-D的培养基中，菘蓝外植体更易褐化，并在2，4-D、BAP均为1mg/L时褐化频率最高，达到63.71%（表2）。表2.不同外源激素下菘蓝子叶胚状体诱导频率和褐化频率外源激素NAA 2,4-D BAP 胚状体诱导率（%） 褐化率（%）4月10号 4月14号 4月17号 4月10号 4月14号 4月17号0.2 - 2.0 12.36 26.87 30.66 0 0 02.0 - 2
11、.0 23.46 47.14 58.57 0 1.67 1.671.0 - 1.0 19.63 33.21 50.71 0 0 9.52- 1.0 1.0 0 0 0 21.15 40.38 63.71- 2.0 2.0 0 0 0 15.67 21.92 47.770.1 - 0.1 0 0 0 0 0 0时间/d020406080101520诱导率%子叶下胚轴图2 子叶和下胚轴胚状体诱导率的比较2.3 不同秋水仙素浓度及处理时间对菘蓝胚状体诱导频率和加倍频率的影响试验结果表明，较低的秋水仙素浓度下菘蓝子叶在相同激素配比的培养基中所得的胚状体数及频率更高，尤其在50mg/L秋水仙素浓度处理3
12、d时胚状体频率高达100%；但是，在低的秋水仙素浓度下所形成的胚状体均为二倍体。随着秋水仙素浓度的逐渐升高，子叶所形成的胚状体数急剧下降，可胚状体的染色体加倍率却有升高的趋势，以200mg/L秋水仙素处理6d获得的加倍胚状体数最多，其加倍频率达到41.1%。随着秋水仙素浓度的继续升高，子叶的胚状体频率及染色体加倍频率均下降（表3），可见，秋水仙素浓度为200mg/L、处理时间为6d时染色体加倍效果最好，秋水仙素的处理浓度过大，处理时间过长对外植体有毒害作用。表3 不同秋水仙素浓度及不同处理时间对崧蓝子叶胚状体染色体加倍的影响秋水仙素浓度/mgL-1处理时间/d处理外植体数/个可出苗外植体数/个
13、诱导率/%染色体加倍的外植体数/个加倍率/%5033030100006302893.3009302996.70015302686.727.720302583.3001003302893.3310.76302686.7519.29302170628.615301860211.120301653.3002003302170523.86301756.7741.19301343.3538.515301136.7327.32030516.71205003301653.3212.56301240325930723.300153026.70020300000注：可出苗外植体数为可出诱导苗的外植体数诱导率（%）=（该处理下出诱导苗数）/（该处理下处理外植体数总数）100%变异率（%）=（染色体加倍的外植体数）/（可出苗外植体数）100%2.4 菘蓝染色体加倍植株的