1、水和饮料中细菌总数和总大肠菌群的测定1、 实验目的1.1学习水样的采取方法、了解和学习水中细菌总数和大肠菌群的测定原理和测定意义。1.2学习和掌握用稀释平板计数法测定水中细菌总数的方法。1.3学习和掌握水中大肠菌群的检测方法。2、 实验原理2.1水中细菌总数可说明被有机物污染的程度，细菌数越多，有机物质含量越大。所谓细菌总数是指1mL或1g检样在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基中，37经24h培养后，所生长的菌落数。本实验所用的方法是稀释平板计数法，由于计算的是平板上形成的菌(colony-forming unit，cfu)数，故其单位应是cfu/g(mL)。它反映的是检样中活菌的数量。2.2所谓大肠菌
2、群，是指在37、24h内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌的总称，主要由肠杆菌科中四个属内的细菌组成，即埃希氏杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。水的大肠菌群数是指100mL水检样内含有的大肠菌群实际数值，以大肠菌群最近似数(MPN)表示。2.3水中大肠菌群的检验方法，常用多管发酵法和滤膜法。多管发酵法可运用于各种水样的检验，但操作繁琐，需要时间长。滤膜法仅适用于自来水和深井水，操作简单、快速，但不适用于杂质较多、易于阻塞滤孔的水样。多管发酵法包括：初发酵试验、平板分离和复发酵试验。2.3.1初发酵试验发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉式小套管。乳糖能起
3、选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖产酸产气。培养基内加溴甲酚紫作为pH指示剂，细菌产酸后，培养基由紫变黄。发酵管经37培养24h，小套管中有气体形成，并且培养基浑浊，颜色改变，说明说中存在大肠菌群，为阳性结果。但是，有个别其他类型的细菌此条件下可能产气，且产酸不产气的发酵管，也不一定非大肠菌群，因其也可能延迟48小时才产气，这两种情况应视为可疑结果，因此需继续进行下面实验，才能确定是否为大肠菌群。48小时后仍不产气的为阴性结果。2.3.2平板分离伊红美蓝琼脂平板含有伊红和美蓝染料，在此亦作为指示剂，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时，该两种染料即结合成复合物，使大肠菌群产生带
4、核心的、有金属光泽的深紫色菌落。初发酵管24h内产酸产气和48小时产酸产气的均需在以上平板上划线分离，培养后，将符合大肠菌群菌落特征的菌落进行革兰氏染色，只有染色为革兰氏阴性、无芽孢杆菌的菌落，才是大肠菌群菌落。2.3.3复发酵试验将以上证实为大肠菌群阳性的菌落，接种复发酵，其原理与初发酵相同，经24h培养产酸又产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。根据确定有大肠菌群存在的初发酵管数目，查阅专用统计表，得出总大肠菌群指数。3、 实验器材3.1培养基3.1.1普通乳糖蛋白胨培养液蛋白胨 10g，牛肉膏 3g，乳糖5g，氯化钠 5g，1.6溴甲酚紫乙醇液 1.0mL，蒸馏水 1000mL，pH 7.
5、27.4。将蛋白胨、牛肉膏、乳糖、氯化钠加热溶解于1000mL蒸馏水中，调节pH为7.27.4，再加入1.6溴甲酚紫乙醇液1.0mL，充分混匀，分装于有德汉氏小管的试管中，每管10mL，115灭菌20min。 3.1.2三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液 按上述普通乳糖蛋白胨培养液浓缩三倍配制，分装于有德汉氏小管的试管中，每管5mL。 3.1.3伊红美蓝培养基（EMB培养基）（供发酵法平板分离用）蛋白胨10g，乳糖10g，K2HPO4 2.0g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，2伊红（曙红）水溶液 20mL，5美蓝（亚甲蓝）水溶液13mL，pH 7.27.4。3.2溶液和试剂自来水、奶茶、池塘水、革兰氏
6、染色液、无菌水等3.3仪器和其他用品显微镜、载玻片、灭菌三角瓶、灭菌带塞空瓶、灭菌移液管、灭菌试管、德汉氏小管、灭菌培养皿。4、 操作步骤4.1水样的采集：4.1.1自来水：先将自来水龙头用火焰灼烧3分钟灭菌，再开放水龙头使水流五分钟后，在火焰旁打开灭菌三角烧瓶瓶塞，接取水样以备分析。4.1.2池塘水：在距岸边5m处，取距水面10-15cm的深层水样，先将灭菌的具塞三角瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出。4.1.3 奶茶：在无菌操作下，将已封闭的饮料打开，在火焰旁用三角瓶取样，并迅速进行分析4.2 水样中细菌总数的检测 4.2.1 自
7、来水中细菌总量的检测4.2.1.1用灭菌吸管吸取1ml水样，注入灭菌培养皿中。共做两个平皿。4.2.1.2分别倾注约15ml已溶化并冷却到45度左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，并立即放在平整的桌面上，做平面旋转摇动，使水样与培养基充分混匀。 4.2.1.3另取一灭菌培养皿，不加水样，倾注牛肉膏蛋白胨琼脂培养基15ml，做空白对照。4.2.1.4培养基凝固后，倒置于37度，培养24小时，进行菌落计数。两个平板的平均菌落数，即为1ml水样的细菌总数。4.2.2水样稀释及培养：4.2.2.1 按无菌操作法，将水样按10倍稀释法稀释。4.2.2.2根据对水样污染情况的估计，选择2-3个适宜稀释度(奶茶选
8、择1：10、1：100、1：1000；池塘水选择1:100、1:1000、1:10000三种稀释度)，吸取1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作2个重复。4.2.2.3将熔化后保温度45的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒平皿，每皿约15mL，并趁热转动平皿混合均匀。4.2.2.4待琼脂凝固后，将平皿倒置于37培养箱内培养24h后取出，计算平皿内菌落数目，乘以稀释倍数，即得1mL水样中所含的细菌菌落总数。4.2.3稀释水样检测平板的菌落计数方法。4.2.3.1平板菌落数的选择：选取菌落数在30-300之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个重复时，应选取两个平板的平均数。如果一个平板有较大片状
9、菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板计数作为该稀释度的菌数。若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，可计算半个平板后乘2以代表整个平板的菌落数。4.2.3.2稀释度的选择：4.2.3.2.1若只有一个稀释度的平均菌落数在30-300之间，则以该稀释度乘以该稀释倍数 (表1例1)。4.2.3.2.2若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30-300之间，则视二者之比如何来决定。若其比值小于2，应取其平均数；若比值大于2，则取其中较小的数字(表l例2、例3)。4.2.3.23若所有稀释度的平均菌落均大于300，则应取稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数 (表l例4)。4.
10、2.3.24若所有稀释度的平均菌落数均小于30、则应按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(表1例5)。4.2.3.2.5若所有稀释度的平均菌落数均不在30-300之间，则以最接近30或300的平均菌落数乘以该稀释倍数报告之(表l例6)。表 1 计算菌落总数方法举例列次不同稀释度的平均菌落数两个稀释度菌落数之比菌落总数/（cfu/mL）备注10-110-210-31136516420-16400或1.64104两位以后的数字采取四舍五入的方法22760295461.637750或3.810432890271602.227100或2.71044无法计数1650513-513000或5.11
11、05527115-270或2.71026无法计数30512-30500或3.11044.3多管发酵法测定水中总大肠菌群4.3.1自来水样的检测4.3.1.1初步发酵试验：在2个各装有50mL的3倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的三角瓶中(内有倒置杜氏小管)，以无菌操作各加水样100mL。在10支装有5mL的3倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的发酵试管中(内有倒置小管)，以无菌操作各加入水样10mL。摇匀后，37培养24h，24h未产气的继续培养48h。4.3.1.2平板分离：将经24h培养后产酸产气及48h培养后产气产酸的发酵管(瓶)，分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板(EMB培养基)上，37培养18-24h。将符合
12、下列特征菌落：呈紫黑色，具有或略带有或不带有金属光泽，或者呈淡紫红色，仅中心颜色较深；挑取符合上述特征的菌落进行涂片，革兰氏染色，镜检。4.3.1.3复发酵试验： 将上述经染色为革兰氏阴性无芽胞杆菌的典型菌落的剩余部分接于乳糖蛋白胨发酵管中，为防止遗漏，每管可接种来自同一初发酵管的平板上同类型菌落13个，37培养24h，如果产酸又产气者，即证实有大肠菌群存在。证实存在后，再根据初发酵试验的阳性管（瓶）数查表2，即得总大肠菌群。表2 总大肠菌群检索表100ml阳性管10ml阳性管012备注每升水样中总大肠菌群数03411接种水样总量300mL（100 mL2份，10 mL10份）13818271
13、32731118384142452518307062236927274312083151161936602301040692304.3.2奶茶、池塘水等的检测4.3.2.1将奶茶水样稀释成10-1 、10-2，接种水样总量11.11ml，其中10，0.1，0.01ml各一份，池塘水稀释成10-2、10-3、10-4，接种水样总量1.111ml，其中1，0.1，0.01,0.001ml各一份。4.3.2.2分别吸取1ml各稀释度的水样和1ml原水样，各注入装有10ml乳糖蛋白胨发酵管中。另取10ml和100ml原水样，分别注入装有5ml和50ml3倍浓度乳糖蛋白发酵液的试管（瓶）中。混匀后，37
14、培养24h，24h未产气继续培养至48h。4.3.2.3以下步骤与上述自来水检测的平板分离和复发酵试验相同。证实有大肠菌群存在后，将奶茶水样的发酵管结果查表3，将池塘水样的发酵管结果查表4。表3 总大肠菌群检索表（中度污染水）接种水样量/mL每升水样中大肠菌群数备注1010.10.01-90接种水样总量为11.11（10，1，0.1，0.01 mL各一份）-+90-+-90-+-95-+180-+-+190-+-220+-230表4 总大肠菌群检索表（严重污染水）接种水样量/mL每升水样中大肠菌群数备注10.10.010.001-900接种水样总量为1.111（1，0.1，0.01，0.001mL各一份）-+900-+-900-+-950-+1800-+-+1900-+-2200+-2300-+2800+-+9200+-+-9400+-+18000+-23000+-+96000+-238000+