1、微生物实验 实验七 测定细菌生长曲线一、 实验目的1. 了解细菌生长曲线特征，测定细菌繁殖的代时；2. 学习液体培养基的配制以及接种方法；3. 反复练习无菌操作技术；4. 了解不同细菌，不同接种方法在同一培养基上生长速度的不同；5. 掌握利用细菌悬液混浊度间接测定细菌生长的方法二、 实验原理将一定量的细菌接种在液体培养基内，在一定条件下培养，可观察到细菌的生长繁殖有一定的规律性，如以细菌的活菌数的对数作纵坐标，以培养时间作横坐标，可绘成一条曲线，成为生长曲线（如图一）。 图一 微生物生长曲线示意图单细胞微生物的发酵具有四个阶段，即调整期（延滞期）、对数期（生长旺盛期）、平衡期（稳定期）、死亡期
2、（衰亡期）。生长曲线可表示细菌从开始生长到死亡的全过程的动态。不同的微生物有不同的生长曲线，同一种微生物在不同的培养条件下，其生长曲线也不一样。因此，测定微生物的生长曲线对于了解和掌握微生物的生长规律是很有帮助的。测定微生物生长曲线的方法很多，有血球计数板法、平板菌落计数法、称重法和比浊法等。本实验采用比浊法测定，由于细菌悬液的浓度与混浊度成正比，因此，可利用分光光度计测定细菌悬液的光密度来推知菌液的浓度。将所测得的光密度值（OD600）与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线。注意，由于光密度表示的是培养液中的总菌数，包括活菌与死菌，因此所测定的生长曲线的衰亡期不明显。从生
3、长曲线我们可以算出细胞每分裂一次所需要的时间，即代时，以G表示。其计算公式为： 式中t1和t2为所取对数期两点的时间；W1和W2分别为相应时间测得的细胞含量（g/L）或OD。三、 实验仪器、材料和用具1. 实验材料:大肠杆菌，枯草杆菌菌液及平板；2. 培养基:牛肉膏蛋白胨葡萄糖培养基3. 实验仪器:取液器(5000ul, 1000ul 各一支);培养箱, 摇床，722s分光光度计；4. 实验用具:无菌1000ul吸头80个;无菌5000ul吸头2个;比色皿9个+共用参比杯一个.四、 实验步骤1. 准备菌种：将细菌接种到牛肉膏蛋白胨葡萄糖三角瓶培养基中，37振荡培养18h，另外准备单菌落平板各1
4、块2. 分为三个小组： 第（1）小组取1.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基, 37 200rpm取3.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基，37 200rpm取5.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基，37 200rpm第（2）小组 取一个大肠杆菌菌落接种到100ml培养基， 37 200rpm取1.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基，37 110rpm取1.0ml大肠杆菌接种到100ml培养基， 30 200rpm第（3）小组 取1.0ml枯草杆菌接种到100ml培养基， 37 200rpm取1.0ml枯草杆菌接种到100ml培养基， 30 200rpm取1.0ml枯草
5、杆菌接种到100ml培养基， 37 110rpm每培养一小时取样一次(2.5h,3.5h加测1次). 对照组测量起始pH,所有瓶子测量发酵9h结束测pH. 3. 测量：选用600nm波长，以蒸馏水作为参比，开始培养前测定每组培养液的OD值作为起始点。开始培养后，每小时吸取测定一次OD值。 五、 实验结果及分析1. 实验数据：表一 三个小组时间-OD数据开始取样时间10:5512:0112:3913:1713:53结束取样时间9:5511:0112:0912:4713:2313:59发酵时间0122.533.5ODt大肠杆菌单菌落0.0040.0240.0270.0270.0250.036371
6、10rpm-0.0100.0490.1640.2550.3120.32730200rpm-0.0100.0430.0880.1580.2420.3611.0mL0.0100.0700.1580.2660.3720.4363.0mL0.0390.0960.2570.3730.4200.4515.0mL0.0670.1340.3020.3610.3340.456枯草杆菌37200rpm0.0080.0230.0760.1320.1840.25430200rpm0.0130.0320.0520.0880.0910.12537110rpm0.0070.0170.0980.1300.2300.253OD
7、=ODt-OD0大肠杆菌单菌落0.0040.0200.0230.0230.0210.03237110rpm-0.0100.0590.1740.2650.3220.33730200rpm-0.0100.0530.0980.1680.2520.3711.0mL0.0100.0600.1480.2560.3620.4263.0mL0.0390.0570.2180.3340.3810.4125.0mL0.0670.0670.2350.2940.2670.389枯草杆菌37200rpm0.0080.0150.0680.1240.1760.24630200rpm0.0130.0190.0390.0750.
8、0780.11237110rpm0.0070.0100.0910.1230.2230.246开始取样时间14:2915:3516:4317:5018:5719:0720:12结束取样时间14:3515:4316:5017:5719:0920:0721:12发酵时间45678910ODt大肠杆菌单菌落0.0650.2670.3950.4540.45737110rpm0.3330.3400.3420.3600.36230200rpm0.4390.5660.5700.5880.5861.0mL0.4640.4460.4460.4580.4403.0mL0.4870.4700.4570.4830.45
9、85.0mL0.4690.4570.4640.4820.478枯草杆菌37200rpm0.3370.4280.5170.5900.6860.7110.71130200rpm0.1710.2610.3700.5400.6280.6060.65237110rpm0.2950.3020.3050.3050.3520.3520.378OD=ODt-OD0大肠杆菌单菌落0.0610.2630.3910.4500.45337110rpm0.3430.3500.3520.3700.37230200rpm0.4490.5760.5800.5980.5961.0mL0.4540.4360.4360.4480.4
10、303.0mL0.4480.4310.4180.4440.4195.0mL0.4020.3900.3970.4150.411枯草杆菌37200rpm0.3290.4200.5090.5820.6780.7030.70330200rpm0.1580.2480.3570.5270.6150.5930.63937110rpm0.2880.2950.2980.2980.3450.3450.3712. 作图、简要分析及代时计算：1） 取一个大肠杆菌菌落接种到100ml培养基， 37 200rpm图一 单菌落大肠杆菌生长曲线 这条曲线属于比较标准的“S”形曲线，很容易看出调整期和对数期，由于单菌落菌较少，
11、而且从固体培养基转移至液体培养基环境变化较大，所以出现了长达4小时的调整期，但可以看出，调整期之后这瓶菌都生长良好。计算代时：取培养4小时到5小时之间的数据（对数生长期）来计算代时。由代时计算公式，t2t1=1h W1=0.061 W2=0.263代时 2） 取1.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基，37 110rpm 图二 大肠杆菌菌生长曲线（取1.0ml大肠杆菌接种到100ml培养基，37 110rpm）接种后几乎没有调整期出现，大肠杆菌很快适应了新的环境并开始呈指数增长，估计是新的培养环境和原有环境较一致，而且在培养最初的时候溶氧和酸碱度都较为适宜，但是这瓶菌是稳定期OD最小的，估
12、计是培养基最初分装不均产生的。计算代时：取培养2小时到2.5小时之间的数据（对数生长期）来计算代时。由代时计算公式，t2t1=0.5h W1=0.174 W2=0.265代时 3） 取1.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基，30 200rpm图三 大肠杆菌生长曲线（取1.0ml大肠杆菌接种到100ml培养基，30 200rpm）可以看出温度对大肠杆菌适应环境产生了一定的影响，使它在调整期滞留了较长的时间，且在对数期增长较慢，应该是酶活性对细胞复制的影响所致。计算代时：取培养2.5小时到3.5小时之间的数据（对数生长期）来计算代时。由代时计算公式，t2t1=1h W1=0.168 W2=0
13、.371代时 4） 取1.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基, 37 200rpm图四 大肠杆菌生长曲线（取1.0ml大肠杆菌接种到100ml培养基, 37 200rpm）这是大肠杆菌培养的最适调节，可以看出其生长良好，调整期较短，对数期较长。计算代时：取培养2小时到3小时之间的数据（对数生长期）来计算代时。由代时计算公式，t2t1=1h W1=0.148 W2=0.362代时 5） 取3.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基，37 200rpm 图五 大肠杆菌生长曲线（取3.0ml大肠杆菌接种到100ml培养基，37 200rpm）接种量的增加没有产生太大的影响，生长曲线没有太大变化。计算代时：取培养2小时到2.5小时之间的数据（对数生长期）来计算代时。由代时计算公式，t2t1=0.5h W1=0.218 W2=0.334代时 6） 取5.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基，37 200rpm图六 大肠杆菌生长曲线（取5.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml