1、诱导性多能干细胞【关键词】 干细胞; 细胞分化; 转录因子诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPS）是通过基因转染技术(gene transfection)将某些转录因子导入动物或人的体细胞, 使体细胞直接重构成为胚胎干细胞（embryonic stem cell, ES）细胞样的多潜能细胞。iPS细胞不仅在细胞形态、 生长特性、 干细胞标志物表达等方面与ES细胞非常相似, 而且在DNA甲基化方式、 基因表达谱、 染色质状态、 形成嵌合体动物等方面也与ES细胞几乎完全相同。iPS细胞的研究受到人们广泛的关注, 是目前细胞生物学和分子生物学领域的研
2、究热点。iPS细胞技术诞生还不到2年, 却为干细胞的基础研究和临床疾病治疗研究带来了前所未有的希望, iPS细胞技术的出现使人们从ES细胞和治疗性克隆等激烈的伦理学争论中解脱出来。但是, 目前制备iPS细胞的方法在安全性方面还存在一定问题, 因此探索一种高效、 安全的iPS细胞的制备方法显得十分必要。 1 iPS细胞的制备方法 2006年Takahashi等1研究小组利用分别携带Oct4、 Sox2、 Myc和Klf4转录因子的4种逆转录病毒载体感染小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts, MEFs), 经过G418药物筛选成功获得第1批iPS细胞。但是这批
3、iPS细胞系中DNA甲基化的方式与自然存在的ES细胞不同, 而且这批iPS细胞不能形成畸胎瘤。Okita等2研究小组报道了第2批iPS细胞的产生。他们采用与制备首批iPS细胞相同的方法, 但是采用了不同的筛选基因。第2批iPS细胞系DNA甲基化的方式与自然存在的ES细胞的甲基化方式相同, 并且能形成畸胎瘤。2007年末, Takahashi和Yu等3, 4两研究小组分别在细胞和科学杂志上报道关于iPS研究里程碑的实验结果, 他们都成功获得了人的iPS细胞系。Yamanaka采用与诱导小鼠iPS相同的方法, 成功将人成纤维细胞诱导成多干细胞。Thomson研究小组采用与Yamanaka不同的方法
4、, 他们利用慢病毒载体运输Oct4、 Sox2、 Nanog和Lin28转录因子转染IMR90胚胎成纤维细胞, 并且成功地获得了人iPS细胞。2008年1月Nakagawa等5研究小组报道他们可以利用Oct4、 Sox2和Klf4 3种转录因子将小鼠和人的成纤维细胞成功诱导出iPS细胞。Aoi等6研究小组将小鼠肝细胞和胃上皮细胞成功诱导为iPS。Stadtfeld等7实验小组利用Oct4、 Sox2、 cmyc和Klf4 4种转录因子将胰岛 细胞诱导为iPS细胞。 Hanna等8研究小组在细胞杂志上报道了他们将小鼠终末分化的B淋巴细胞诱导成iPS细胞的实验结果。他们采用类似于利用成纤维细胞制备
5、iPS细胞的方法, 使用4种转录因子（Oct4、 Sox2、 cMyc和Klf4）及CCATT/增强子结合蛋白（C/EBP）, 成功地将成熟B淋巴细胞诱导为iPS细胞。 Eminli等9研究小组利用逆转录病毒载体携带Oct4、 Klf4和cMyc 3个转录因子将神经祖细胞诱导为iPS细胞, 之后Kim等10研究小组报道利用慢病毒载体携带Oct4和cMyc或Oct4与Klf4两种转录因子就可以将成人的神经干细胞诱导为iPS细胞。他们检测到在成人神经干细胞中Oct4和cMyc的表达量高于胚胎干细胞中Oct4和cMyc的表达量, 因此考虑利用逆转录病毒载体只携带两种转录因子诱导成人神经干细胞为iPS
6、细胞并获得成功。由此他们推测当被诱导的体细胞中高表达某个或某几个转录因子时, 可以减少其他转录因子的使用。 当一系列人正常体细胞被诱导成iPS细胞之后, 科学研究者开始研究患者的细胞是否也能诱导成iPS细胞。Dimos等11研究小组报道他们将肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis, ALS）患者的细胞成功诱导成为iPS细胞。随后Park等12报道他们将腺苷脱氨酶缺陷相关严重的联合免疫缺陷、 三型葡萄糖脑苷脂沉积症、 帕金森综合征、 舞蹈症、 青少年I型糖尿病等患者的细胞诱导为iPS细胞。 体细胞可以诱导为iPS细胞, 但是获得iPS细胞的几率很低。于是科学
7、研究者们研究能否找到提高iPS细胞产生效率的方法。Mali等13报道他们将SV40大T抗原和Oct4、 Sox2、 cMyc和Klf4同时诱导成纤维细胞能显著提高iPS细胞产生的效率, 而且iPS细胞提前12周产生。Huangfu等14报道DNA甲基化转移酶和组蛋白去乙酰化酶抑制剂能显著提高iPS细胞产生的效率。Aasen等15研究小组报道采用逆转录病毒运输Oct4、 Sox、 Klf4和cmyc诱导人角化细胞产生iPS细胞的效率比诱导人成纤维细胞产生iPS细胞的效率至少提高100倍, 而且大大缩短了产生iPS细胞的时间。 Maherali等16研究小组报道了制备iPS细胞新的研究平台, 并指
8、出可从分子、 遗传和生化机制上改造细胞程序重排技术。他们开发了一种新的iPS细胞诱导技术, 采用doxycycline诱导转录因子的表达, 从而可以通过药物来控制iPS细胞的产生, 其制备的iPS细胞从结构和功能上都与人类胚胎干细胞很相似。人们研究发现, 不同的皮肤细胞类型用于诱导产生iPS细胞的时间也不同16。Huangfu等17研究小组报道仅利用反转录病毒表达Oct4和Sox2两种转录因子, 同时借助抑制组蛋白去乙酰基酶活性的小分子化合物丙戊酸（Valproic Acid, VPA）的作用就能将人的成纤维细胞系BJ和NHDF逆转成iPS细胞。 最近, Stadtfeld等18报道他们利用腺
9、病毒载体运输Oct4、 Sox2、 Klf4和cMyc 4种转录因子成功获得无病毒整合的iPS(AdenoiPS)细胞。Okita等19研究小组采用2种质粒分别携带Oct4、 Sox2和Klf4 3种转录因子和cmyc转录因子共转染人或小鼠的体细胞并使之诱导成为iPS细胞, 经过检测并无质粒整合进入iPS细胞基因组中, 即获得了在基因组水平无转录因子整合的iPS细胞。Frank 等采用带有loxpCre 系统的病毒载体诱导iPS, 此系统可将整合到iPS基因组中的4种外源转录因子及病毒基因成分完全剔除, 因而所获得了完全没有病毒基因组的来源于Parkinson患者成纤维细胞的iPS; 而Knu
10、t 等人使用含有转座子系统的病毒载体也成功获得了完全没有病毒基因组的来源于人胚胎成纤维细胞的iPS。这些无病毒基因组成分的iPS诱导成功为其临床实际应用奠定了基础。iPS细胞产生的方法归纳见表1。表1 诱导iPS产生的方法 小鼠胚胎成纤维细胞13Oct4, Sox2, Klf4小鼠及人成纤维细胞5Oct4, Klf4, cmyc神经祖细胞9Oct4, Klf4成人神经干细胞10Oct4, cmyc成人神经干细胞10Oct4, Sox2, cmyc, Klf4, Nanog人角质细胞16Oct4, Sox2人成纤维细胞系BJ and NHDF17 2 iPS细胞的应用 iPS细胞技术是一把了解细
11、胞核基因组重序(reprogramming)的钥匙, 因为iPS细胞在功能上与胚胎干细胞几乎完全相同。因此, iPS细胞的诱导产生过程将是我们了解基因组重序分子机制和个体特异的疾病发生机制的最理想的模型。Hanna等20近期已经进行了iPS细胞应用基础研究的首次尝试, 利用人类镰状细胞性贫血的小鼠动物模型, 取其尾尖部皮肤的成纤维细胞, 通过导入Oct4、 Sox2、 Klf4和cMyc基因, 获得自体iPS细胞; 进一步采用基因特异性打靶技术对人类镰状血红蛋白等位基因进行纠正后, 将体外培养的自体iPS细胞诱导为造血干细胞, 移植后可治疗动物模型的镰状细胞性贫血。Dimos等11报道将ALS
12、患者的体细胞诱导获得的iPS细胞成功定向分化为运动神经元, 而ALS疾病的特征就是患者的运动神经元受到破坏。与此同时, Martin 研究小组发表将Oct4、 Sox2、 Klf4和cMyc诱导得到的iPS细胞定向分化为有功能的心肌细胞的研究结果。 3 iPS的安全性 iPS细胞技术的问世为生命科学的研究和人类疾病的治疗带来巨大的希望, 随着研究的深入进行, 多种终末分化细胞甚至是患者的细胞都能被诱导成iPS细胞, 还有iPS细胞初步应用小鼠疾病模型治疗的成功, 这一切似乎预示着iPS细胞距人类疾病的临床治疗不远了。但是, iPS在投入临床疾病治疗之前, 必须考虑iPS细胞安全性的问题。目前制
13、备iPS细胞的方法主要是利用逆转录病毒运输系统将几种转录因子导入体细胞, 逆转录病毒在染色体上随机插入整合到体细胞基因组内并启动转录因子的表达。逆转录病毒的随机插入存在着潜在的风险, 有的转录因子如cmyc和Klf4, 它们本身就是一种原癌基因, 导入cMyc基因可使嵌合体小鼠的肿瘤发生率高达20%2。由于cMyc基因具有危险性, 研究者投入无cMyc基因的iPS研究, 但是经过研究发现这些无cMyc基因的iPS细胞依然具有致瘤性。 4 展望 iPS细胞技术诞生还不到2年, 但却受到极大的关注和广泛的研究, 现已成为生命科学研究领域研究和探讨的焦点, 为基础研究和临床疾病治疗带来前所未有的希望
14、。人类iPS细胞的建立被公认为2007年最重要的科技进展之一, 这项技术不仅可以从体细胞建立个体特异的多能干细胞系, 解决了细胞移植治疗中的免疫排斥问题, 而且为研究人类细胞的重编程的机理以及研究个体特异的疾病发生机理提供了有力的方法。在干细胞研究领域, iPS细胞技术的出现无疑是具有里程碑意义的突破, 多种体细胞经过体外培养和诱导均可转变成为具有多向分化潜能的干细胞, 并且证明了几种已知的转录因子可以使已分化的体细胞逆转为未分化的状态, 表明细胞的巨大可塑性。但是, iPS细胞在应用于临床之前, 还面临许多问题:逆转录病毒和慢病毒载体导致肿瘤发生的潜在风险需要加以有效防范; 需要深入研究比较
15、iPS细胞和hES细胞在细胞生物学特性、 定向分化机制等方面是否具有显著的差异; 需建立一种新的方法以避免基因转染或基因转导带来的潜在风险, 如通过某些化学药物或因子激活体细胞中固有的上述转录因子的方式以替换外源性基因转染的方式, 或者用某些因子的短暂性表达代替永久性导入; 提高制备iPS细胞的效率。需指出的是, iPS细胞研究的突破并不意味着ES细胞研究的衰亡, 因为iPS细胞所使用的转录因子正是来源于ES细胞长期研究的积累。【参考文献】 1 Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factorsJ. Cell, 2006, 126(4): 663-676.2 Okita K, Ichisaka T, Yamanaka S. Generation of germlinecompetent induced pluripotent stem cellsJ. Nature, 2007, 448(7151): 313-317.3 Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, et al. Induction of pluripotent