1、Central Laboratory of Biology 水体中大肠菌群的测定 微生物学实验 Central Laboratory of Biology College of Life Sciences,Hubei Normal University 【课前预习课前预习】1.典型的大肠杆菌群菌落特征是什么？典型的大肠杆菌群菌落特征是什么？2.食品中大肠菌群数测定的意义是什么？食品中大肠菌群数测定的意义是什么？Central Laboratory of Biology College of Life Sciences,Hubei Normal University 【目的要求目的要求】1.学习
2、和掌握大肠菌群的测定方法（多管学习和掌握大肠菌群的测定方法（多管发酵法）发酵法）2.了解测定过程中每一步的反应原理。了解测定过程中每一步的反应原理。3.了解大肠菌群的数量在饮水中的重要性了解大肠菌群的数量在饮水中的重要性 Central Laboratory of Biology College of Life Sciences,Hubei Normal University 【实验原理实验原理】大肠菌群是一群能在大肠菌群是一群能在37培养培养48h内发酵乳糖产酸内发酵乳糖产酸、产气的需氧或兼氧革兰氏染色阴性无芽抱杆菌。、产气的需氧或兼氧革兰氏染色阴性无芽抱杆菌。以大肠杆菌为主，包括肠细菌属、
3、柠檬酸细菌属、以大肠杆菌为主，包括肠细菌属、柠檬酸细菌属、埃希氏菌属和克雷伯氏菌属等。埃希氏菌属和克雷伯氏菌属等。大肠菌群在肠道和粪便中数量非常高，且与肠道和大肠菌群在肠道和粪便中数量非常高，且与肠道和粪便中的病原菌生活习性相近，可作为判断样品是粪便中的病原菌生活习性相近，可作为判断样品是否被人、畜粪便污染的标志。否被人、畜粪便污染的标志。Central Laboratory of Biology College of Life Sciences,Hubei Normal University 发酵法：发酵法：又称多管发酵法或三步发酵法又称多管发酵法或三步发酵法(此法是根据大肠菌群具有发酵乳糖
4、产酸产气的特性，此法是根据大肠菌群具有发酵乳糖产酸产气的特性，利用含乳糖的培养基培养不同稀释度的样品经初发酵利用含乳糖的培养基培养不同稀释度的样品经初发酵、平板分离和复发酵、平板分离和复发酵3个检测步骤，最后根据结果查个检测步骤，最后根据结果查最大自然数（最大自然数（most probable number）表，算出食）表，算出食品中的大肠菌群数。品中的大肠菌群数。)Central Laboratory of Biology College of Life Sciences,Hubei Normal University 1)初发酵（推测试验）：初发酵（推测试验）：将不同稀释度的水样，分别接种
5、于含有乳糖等糖将不同稀释度的水样，分别接种于含有乳糖等糖 类的培养液中（类的培养液中（3倍或倍或1倍乳糖培养基，视所加的水样倍乳糖培养基，视所加的水样 体积和培养基体积而定），经体积和培养基体积而定），经37 C培养培养24 h，观察产，观察产 酸产气情况，以初步判断是否有大肠菌群存在。酸产气情况，以初步判断是否有大肠菌群存在。Central Laboratory of Biology College of Life Sciences,Hubei Normal University 发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置杜杜氏小套管氏小套管。乳糖乳糖能
6、起选择作用，因为很多细菌不能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。为便于观察细菌的。为便于观察细菌的产酸产酸情况，培养基内加有情况，培养基内加有溴溴甲酚紫作为甲酚紫作为pH指示剂，指示剂，细菌产酸后，培养基即由细菌产酸后，培养基即由原来的紫色变为黄色。溴甲酚紫还有抑制其他细原来的紫色变为黄色。溴甲酚紫还有抑制其他细菌如芽孢菌生长的作用。菌如芽孢菌生长的作用。Central Laboratory of Biology College of Life Sciences,Hubei Normal University 2）平皿
7、分离（证实试验）平皿分离（证实试验）水中除大肠菌群外，尚有其它细菌可能引水中除大肠菌群外，尚有其它细菌可能引起糖类发酵，因此需要进一步证实。起糖类发酵，因此需要进一步证实。将初发酵管中已发酵的菌液接种于伊红美将初发酵管中已发酵的菌液接种于伊红美兰培养基，兰培养基，37 C培养培养24 h，根据菌落特征，根据菌落特征，挑取可能为大肠菌群的菌落制片，经革兰氏染挑取可能为大肠菌群的菌落制片，经革兰氏染色，进一步证实是否为大肠菌群。色，进一步证实是否为大肠菌群。Central Laboratory of Biology College of Life Sciences,Hubei Normal Uni
8、versity 平 板 培 养 基 使 用平 板 培 养 基 使 用 伊 红 美 蓝 琼 脂伊 红 美 蓝 琼 脂（e o s i n methyleneblue agar，EMB agar）。伊红美蓝琼伊红美蓝琼脂平板含有伊红和美蓝染料脂平板含有伊红和美蓝染料，在此亦作为在此亦作为指示剂指示剂，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时，该两种染料即该两种染料即结合成复合物结合成复合物，使大肠菌群产生使大肠菌群产生带核心的带核心的、有金属有金属光泽的深紫色光泽的深紫色（龙胆紫的紫色龙胆紫的紫色）阳性菌落阳性菌落。初发酵初发酵管管24h内产酸产气和内产酸产气和48h产酸产气的
9、均需在以上平板产酸产气的均需在以上平板上划线分离菌落上划线分离菌落。Central Laboratory of Biology College of Life Sciences,Hubei Normal University 3）复发酵试验复发酵试验(完成实验）完成实验）将上述可能为大肠菌群的菌落再次转接入将上述可能为大肠菌群的菌落再次转接入1倍倍乳糖培养液中，经乳糖培养液中，经37 C培养培养24 h，产酸产气者即，产酸产气者即最后确证为存在大肠菌群。最后确证为存在大肠菌群。产酸、产气分别记为阳性反应，不产酸、产产酸、产气分别记为阳性反应，不产酸、产气则记为阴性反应；气则记为阴性反应；根据阳
10、性管数量，查表求得水体大肠菌群的根据阳性管数量，查表求得水体大肠菌群的数量。数量。Central Laboratory of Biology College of Life Sciences,Hubei Normal University 1.被检样品被检样品 根据不同需要选择检检样品（如自来水、湖水等）2.培养基培养基 乳糖胆盐发酵培养基，伊红美蓝固体培养基，乳糖发酵培养基 3.试剂试剂 革兰氏染色液，芽孢染色液 4.其它其它 显微镜，天平，培养箱，水浴锅，研钵，平皿，试管，刻度吸管，涂布器【实验材料实验材料】Central Laboratory of Biology College of
11、Life Sciences,Hubei Normal University 【操作步骤操作步骤】1水样的采取（青山湖水，应取距水面水样的采取（青山湖水，应取距水面10-15cm的深层水样，用灭菌带玻璃塞的瓶子，瓶口向下的深层水样，用灭菌带玻璃塞的瓶子，瓶口向下侵入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水既流侵入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水既流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出）入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出）Central Laboratory of Biology College of Life Sciences,Hubei Normal University 2湖水的检查湖
12、水的检查（1）初（步）发酵实验）初（步）发酵实验 水样的稀释：水样的稀释：10-2、10-3、10-4（用无菌水稀（用无菌水稀释）释）接种：取接种：取0.5ml上三个稀释度的水样接入装有上三个稀释度的水样接入装有4.5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（水样的体积和三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（水样的体积和培养液的体积由试管而定）培养液的体积由试管而定），混匀后，混匀后，37 培培养养24 h。Central Laboratory of Biology College of Life Sciences,Hubei Normal University 水样接种于发酵管内，水样接种于发酵管内，37下培养：下
13、培养：（1）24h内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠杆菌，疑为阳性结果；颜色改变，说明水中存在大肠杆菌，疑为阳性结果；（2）在量少的情况下，也可能延迟）在量少的情况下，也可能延迟48h后才产酸产气后才产酸产气，此时应视为可疑结果。，此时应视为可疑结果。以上两种结果均需继续做下面两部分实验，才能确定是以上两种结果均需继续做下面两部分实验，才能确定是否是大肠菌群。否是大肠菌群。（3）48h后仍不产气的为阴性结果。后仍不产气的为阴性结果。Central Laboratory of Biology College of Life Sc
14、iences,Hubei Normal University （2）平板分离）平板分离 将经将经24 h培养后产酸产气的发酵管，分别划培养后产酸产气的发酵管，分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，再于线接种于伊红美蓝琼脂平板上，再于37 培养培养1824 h，将符合下列特征的菌落进行染色镜检。，将符合下列特征的菌落进行染色镜检。深紫黑色，有金属光泽；深紫黑色，有金属光泽；紫黑色，不带或略带金属光泽；紫黑色，不带或略带金属光泽；淡紫红色，中心颜色较深。淡紫红色，中心颜色较深。Central Laboratory of Biology College of Life Sciences,Hubei No
15、rmal University （3）复发酵试验）复发酵试验 将镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌的菌株重复初将镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌的菌株重复初步发酵试验步发酵试验(利用乳糖蛋白胨培养液利用乳糖蛋白胨培养液)。仍为产酸产。仍为产酸产气者为大肠杆菌阳性。气者为大肠杆菌阳性。（4）结果计算：结果计算：根据三个稀释度中阳性管数组根据三个稀释度中阳性管数组成一个数量指标成一个数量指标，查查MPN计数表计数表10-1 Central Laboratory of Biology College of Life Sciences,Hubei Normal University 10ml100 1ml100 1
16、ml10-1 1ml10-2 3 1 1 1 1支支 各各3支支 Central Laboratory of Biology College of Life Sciences,Hubei Normal University 【实验结果实验结果】1.将实验测出的各样品大肠菌群数以报表方将实验测出的各样品大肠菌群数以报表方式报告结果。式报告结果。2.对样品大肠菌落数作出是否符合卫生要求对样品大肠菌落数作出是否符合卫生要求的结论。的结论。Central Laboratory of Biology College of Life Sciences,Hubei Normal University 【思考题思考题】1.在进行食品中大肠杆菌群数的测定时，为在进行食品中大肠杆菌群数的测定时，为什么要进行复发酵试验？什么要进行复发酵试验？2.典型的大肠杆菌群菌落特征是什么？典型的大肠杆菌群菌落特征是什么？3.食品中大肠菌群数测定的意义是什么？食品中大肠菌群数测定的意义是什么？生物学实验教学中心